Utilización de diferentes técnicas para confirmar ausencia de toxicidad de cepas de Aspergillus oryzae potencialmente bioremediadoras del herbicida glifosato en suelos agrícolas

Abstract

La utilización de hongos como herramientas biotecnológicas para la remediación de plaguicidas contaminantes de diferentes matrices ambientales está siendo cada vez más estudiado, ya que son microorganismos con una amplia capacidad metabólica, versatilidad y su producción a gran escala resulta económica y amigable con el medio ambiente. Sin embargo, la selección de las cepas que van a ser incorporadas al ambiente como agentes bioremediadores deben cumplir ciertas características que aseguren su inocuidad. En esta investigación aislamos cepas de Aspergillus oryzae de suelo agrícola capaces de tolerar y degradar altas concentraciones del herbicida glifosato. Una de las características de estas cepas es que pueden ser capaces de producir una micotoxina muy peligrosa como es la aflatoxina B1 (AFB1). Por lo tanto, antes de proponerla como agente de bioremediación, debemos asegurarnos que las cepas seleccionadas no produzcan la mencionada micotoxina. Los objetivos de este trabajo fueron: a) determinar mediante una técnica cuantitativa la capacidad de producir AFB1 por tres cepas de A. oryzae con capacidad de degradar glifosato y b) determinar mediante PCR con primers específicos de la vía biosintética de aflatoxinas (AFs) la ausencia de alguno de estos genes que permiten la producción de AFB1. Las cepas aisladas (AM1, AM2 y GM3) se cultivaron en agar extracto de malta (AEM) y luego se llevó a cabo la extracción de aflatoxinas y su cuantificación por cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) (Trucksess y col. 1994). Para determinar la presencia/ausencia de los genes de la vía biosintética de AFs, a partir de los cultivos en AEM, se realizó una suspensión de esporas con la que se inocularon Erlenmeyers con 50 mL de medio Wikerman (Mulè y col. 2006). Los cultivos se incubaron a 25°C por 3 días a 150 rpm. El micelio se filtró, lavó y secó para luego ser pulverizado con nitrógeno líquido. Posteriormente se realizó la extracción de ADN genómico y su cuantificación (Leslie y Summerell 2006). Luego se llevó a cabo la amplificación de cuatro de los genes involucrados en la vía de síntesis de las AFs. Estos genes fueron: nor-1, ver-1, omt-A y aflR (Criseo y col. 2008). Los fragmentos fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en buffer TAE (1X) y coloreados con bromuro de etidio para su visualización bajo luz UV (302 nm). Como resultados pudimos determinar que las tres cepas de A. oryzae no tuvieron la capacidad de producir AFB1, es decir que no fueron detectadas por la técnica de HPLC. Además, se observó que para las tres cepas de A. oryzae hubo ausencia de algunos de los genes amplificados: AM1: ausencia del gen aflR, AM2: ausencia de los genes aflR y ver-1, GM3: Ausencia gen omt-A. Estos resultados confirmarían la inocuidad de las cepas bioremediadoras de glifosato y permiten continuar los estudios tendientes a evaluarlas como potenciales productos biotecnológicos a ser utilizados para disminuir la contaminación con glifosato en los suelos agrícolas. Además, permitió a profesionales microbiólogos aplicar diferentes herramientas diagnósticas (químicas y moleculares) para abordar desde diferentes perspectivas, características importantes y distintivas de los microorganismos con potencial aplicación tecnológica.