Purificación a escala piloto de una actividad lipasa producida por Aspergillus niger MYA135. Caracterización cinética y molecular.

Abstract

Introducción y Objetivos: Las lipasas (EC 3.1.1.3) son enzimas de gran importancia industrial debido a la heterogeneidad de aplicaciones que presentan en la industria alimenticia, farmacéutica y otras y en la producción de biocombustibles. Cada una de estas aplicaciones requiere propiedades específicas de las lipasas tales como especificidad, estabilidad térmica, habilidad para catalizar la síntesis de ésteres en solventes orgánicos, etc. En tal sentido, este trabajo tiene como objetivo purificar una actividad lipasa a escala piloto y caracterizar el producto obtenido. Materiales y Métodos: Para esto, se obtuvo 3 l de sobrenadante de cultivo con actividad lipasa a partir de Aspergillus niger MYA 135 utilizando un medio salino suplementado con aceite de oliva (2%, v/v). Se optimizó el proceso de purificación. Se propuso un paso de ultrafiltración seguido de cromatografía hidrofóbica por FPLC (Fast protein liquid chromatography). Resultados: Se logró purificar una proteína con una actividad específica de 13,4 U/mg, con un rendimiento de 6,2% y un factor de purificación de 17,8. La proteína purificada reveló dos bandas en SDS-PAGE. Las mismas fueron analizadas por espectrometría de masa MS y MS/MS, dando como resultado: a) para la banda superior, una identificación en MASCOT con Lipasa Extracelular de Aspergillus niger; Masa: 61 kDa; pI: 4,42; Score:110; Base de datos: NCBIprot y b) para la banda inferior una identificación con Lipasa de Aspergillus niger CBS 513.88; Masa: 31,7 kDa; pI: 4,67; Score: 5,8; Base de datos: NCBIprot. Se determinaron: el punto isoeléctrico (3,75), temperatura (30°C) y pH (7.0) óptimos, y los parámetros cinéticos Vmax (19,16 μmol/min) y Km (0,26 mM), utilizando buffer A (buffer fosfato 100 mM pH 7, goma arábiga 0,1% y tritón 0,4%), una temperatura de incubación de 37°C y p-nitrofenil palmitato como sustrato. Además, se estudió el efecto de agentes que modifican aminoácidos (5 mM): NAI (N-acetylimidazole), NBS (N-bromosuccinimide), EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), IA (idoacetate), DEPC (diethylpyrocarbonate), CA (citraconic anhydride) y PG (phenylglyoxal); y otros compuestos (g/l): FeCl3 1, CaCl2 0,5, ácido oleico 1, glicerol 10, aceite de oliva 20 y Tritón X100 20. Se detectó un efecto de inhibición frente a CA, NAI, PG, DEPC, CaCl2y Tritón; mientras que con el agregado de FeCl3 (Ka=0,17mM) y ácido oleico (Ka=0,05mM) se observó un efecto de activación. Finalmente, se realizaron estudios relacionados con la síntesis de biodiesel utilizando la lipasa purificada e inmovilizada en silica gel por adsorción como catalizador, con aceite de soja crudo y butanol en relación (1:4). Conclusiones: Como resultado, se logró sintetizar biodiesel con éxito, pudiéndose comprobar que esta enzima tiene la capacidad de reaccionar con un sustrato natural y catalizar la transesterificación.