Conservación por liofilización de Lacticaseibacillus paracasei 90: viabilidad, culturabilidad e integridad celular

Abstract

Los cultivos lácticos son conservados a nivel industrial principalmente mediante la tecnología deliofilización, y en menor medida por congelación y secado spray (Santivarangkna et al., 2007).Tanto el proceso de liofilización como las condiciones de almacenamiento de las cepas luego de ser liofilizadas puede generar efectos indeseables en los microorganismos que se quieren conservar, tales como disminuciones de la viabilidad y/o actividad. Por otro lado, la presencia o ausencia de determinados nutrientes en el medio de crecimiento de los cultivos pueden afectar la cantidad de biomasa producida y la actividad del fermento, lo que también puede tener un impacto en la resistencia de los microorganismos a la liofilización y almacenamiento. La cepa autóctonaLacticaseibacillus paracasei 90 (L90) ha demostrado tener un perfil enzimático de interés tecnológico, como lo es la habilidad para producir diacetilo y acetoína (Peralta et al., 2016), compuestos que juegan un papel importante en las propiedades organolépticas de muchas variedades de queso. De esta manera, es de gran interés la evaluación de la resistencia de esta cepa a los procesos de conservación, de modo de poder disponer de la misma en un formato másfácilmente aplicable en la industria. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue evaluar laresistencia de L90 al proceso de liofilización y almacenamiento luego de su crecimiento en dosmedios de cultivo económicos formulados con residuos industriales (M1 y M3) y en un mediocomercial (MRS). La cepa fue reactivada por dos repiques sucesivos en el medio MRS (37 °C-20h), e inoculada (2% v/v) en 1 L de cada uno de los tres medios de cultivos (M1, M3 y MRS), loscuales fueron posteriormente incubados a 34 °C por 20 h. Las células fueron cosechadas y lavadas 2 veces con buffer fosfato de potasio 50 mM, pH 7, y posteriormente resuspendidas en 300 mL deuna solución de lactosa 10% p/v como crioprotector. La suspensión celular en lactosa fuefraccionada en viales de vidrio y congelada a -80 °C. Finalmente, las suspensiones celulares fueronliofilizadas en un ciclo de 24 h utilizando el equipo Christ Alpha 1-4 LD plus. Inmediatamenteluego de la liofilización, los viales fueron cerrados al vacío en el mismo equipo. Los fermentosliofilizados obtenidos fueron rotulados como Lm1, Lm3 y Lmrs, dependiendo si procedían delmedio de cultivo M1, M3 y MRS, respectivamente. El impacto de la liofilización sobre la viabilidade integridad de las cubiertas celulares de L90 se evaluó por recuentos microbiológicos ymicroscopía electrónica de barrido. Además, los cultivos liofilizados envasados al vacío en losviales fueron almacenados por un período de 6 meses a dos temperaturas: TA- temperaturaambiente y TH- temperatura de heladera (4 °C), y el efecto de este almacenamiento sobre laviabilidad de los fermentos liofilizados se evaluó por recuentos microbiológicos y citometría deflujo. Las suspensiones celulares en lactosa, provenientes de los medios M1, M3 y MRS,presentaron niveles de 9,18; 9,79 y 10,11 log UFC/mL, respectivamente, antes de la liofilización.Independientemente del medio de crecimiento, el proceso de liofilización no tuvo un impactosignificativo en la viabilidad de la cepa, ya que únicamente se observaron leves disminucionesluego de este proceso (entre 0,2 y 0,5 log UFC/mL). En las micrografías electrónicas de barrido delos liofilizados antes de ser rehidratados se observó que la mayoría de los lactobacilos estabanatrapados dentro de la matriz amorfa que produce la lactosa cuando se deshidrata, lo que genera un efecto protector principalmente en la etapa de congelado, previa a la sublimación. En particular, en el liofilizado Lm1 se observó una mayor cantidad de células fuera de la matriz de lactosa respecto a Lm3 y Lmrs, lo que podría correlacionarse con la menor supervivencia al almacenamiento que se observó en Lm1. Durante el primer mes de almacenamiento a TH no hubo variación en los niveles de culturabilidad de ninguno de los liofilizados de L90 (Figura 1A). Por el contrario, el almacenamiento a TA condujo a una disminución significativa de los niveles de L90 en los tres polvos. La disminución durante el primer mes fue de 0,93; 0,65 y 0,65 log UFC/mL para losliofilizados Lm1, Lm3 y Lmrs, respectivamente. A los 3 meses de almacenamiento a TA, losniveles de L90 continuaron disminuyendo, alcanzando reducciones respecto a los valores inicialesde 1,90; 1,16 y 1,42 log UFC/mL en los liofilizados Lm1, Lm3 y Lmrs, respectivamente. Por otrolado, los liofilizados Lm1 y Lmrs almacenados a TH no sufrieron cambios luego de 3 meses dealmacenamiento respecto a los niveles iniciales, a diferencia de Lm3 que disminuyósignificativamente (p<0,05). Es importante destacar que si bien la reducción fue estadísticamentesignificativa, el nivel de L90 en el Lm3 continuó siendo elevado (9,22 log UFC/mL). Finalmente, alos 6 meses de almacenamiento a TA, la población viable de L90 continuó disminuyendo, hastaalcanzar niveles de reducción de 4,08; 2,15 y 3,68 log UFC/mL en los liofilizados Lm1, Lm3 yLmrs, respectivamente. Por otra parte, Lm1 almacenado a TH no sufrió cambios significativosrespecto a su nivel inicial, a diferencia de los liofilizados Lm3 y Lmrs. Los resultados obtenidos porcitometría de flujo en cuanto a los porcentajes de células vivas, dañadas y muertas a los 3 y 6 meses de almacenamiento mostraron la misma tendencia que los obtenidos por recuentos microbiológicos. Claramente se observa que las células que fueron almacenadas a TA se desplazan hacia la izquierda (R1 y R2) indicando que la población de células vivas disminuyó (Figura 1B). Aunque la misma tendencia se observó en los tres liofilizados, una mayor proporción de células muertas se presentó en Lm1 en comparación a Lm3 y Lmrs, lo cual fue consistente con los resultados obtenidos por recuentos en placa. Los resultados de este trabajo destacan la robustez de la cepa L90 para sobrevivir a la liofilización y al almacenamiento durante un período de 6 meses, resaltando la importancia del mantenimiento a temperatura de refrigeración durante este período. La liofilización resultó una técnica adecuada para la conservación de L90, independientemente del medio de crecimiento utilizado.