Mejora del desempeño de la lipasa metagenómica LipC12 en la esterificación de ácido oleico mediante estrategias de inmovilización y bioimprinting

Abstract

Se llevó a cabo la inmovilización de la lipasa LipC12 sobre diferentes soportes combinada con la técnica de bioimprinting en una sola etapa. Los soportes seleccionados fueron quitosano, Accurel MP-1000, pellets de polipropileno, polipropileno en polvo, Nanomer I.44P e Immobead 150. La lipasa inmovilizada se aplicó en la síntesis de pentil oleato, compuesto con aplicación como biolubricante.Se estableció un protocolo estándar para la inmovilización de LipC12 en todos los soportes. Para ello, se preparó una solución acuosa del extracto crudo de la lipasa utilizando 8 mg de extracto liofilizado por cada mililitro de agua destilada pH 6,5 y luego se añadió el soporte en una proporción de 20 mg del sólido por mililitro de la solución. La inmovilización se realizó durante 6 h en viales cerrados con agitación magnética a 700 rpm. La preparación inmovilizada se recuperó por filtración, se lavó dos veces con agua destilada y se secó en estufa a 35 °C durante 12 h. El bioimprinting de la lipasa LipC12 se realizó con ácido oleico y en combinación con el procedimiento de inmovilización, en un solo paso. El contenido de moléculas de bioimprinting fue de 30 µmol por cada 100 mg de extracto liofilizado. Las preparaciones de LipC12 inmovilizada, con y sin tratamiento de bioimprinting, fueron evaluadas en la esterificación de ácido oleico y 1-pentanol. Para ello, 2 mmol de 1-pentanol, 1 mmol de ácido oleico y 1 ml de n-heptano se colocaron en viales de 10 ml. La reacción se llevó a cabo por 5 horas a 40 °C, 600 rpm y empleando 15% (p/p) de lipasa inmovilizada respecto a la masa de ácido oleico. La reutilización de los biocatalizadores fue estudiada bajo las mismas condiciones de reacción descritas anteriormente.Los mejores resultados se obtuvieron para la lipasa inmovilizada sobre Nanomer, polipropileno en polvo e Immobead, alcanzando conversiones de ácido superiores al 90% para la lipasa inmovilizada sobre Immobead. En todos los casos se encontraron diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza superior al 95% entre la conversión lograda con y sin bioimprinting para todos los biocatalizadores. Este hecho permite verificar el efecto beneficioso del bioimprinting sobre la actividad de los biocatalizadores en la reacción de esterificación del ácido oleico con 1-pentanol. Las conversiones más altas se lograron utilizando LipC12 inmovilizada sobre soportes con características hidrófobas. Las preparaciones inmovilizadas con mejor desempeño se utilizaron en ocho reacciones de esterificación sucesivas y los mejores resultados se obtuvieron para la lipasa LipC12 inmovilizada en Immobead 150 y quitosano, que mantuvieron 95 y 85% de la actividad inicial, respectivamente. La inmovilización combinada con el tratamiento de bioimprinting, en un solo paso, permitió obtener preparaciones enzimáticas con mayor actividad a través de un proceso simple, en menos tiempo y sin el uso de disolventes orgánicos. Los biocatalizadores mostraron un buen desempeño en la esterificación de ácido oleico y 1-pentanol. El bioimprinting incrementó la actividad catalítica para todos los biocatalizadores obtenidos, los mayores incrementos de actividad se observaron para los biocatalizadores obtenidos utilizando soportes con características hidrofóbicas.