Caracterización de la expresión de citoquinas en animales infectados con el Virus de la Leucosis Bovina con alta y baja carga proviral

Abstract

El virus de la leucosis bovina (BLV) es causal de una enfermedad linfoproliferativa. El desarrollo de los perfiles de infección de alta carga proviral (ACPV) o baja carga proviral (BCPV) estaría relacionado a factores genéticos e inmunológicos. Además de afectar a los linfocitos B, el BLV altera el normal funcionamiento de los linfocitos T y monocitos, resultando en una producción diferencial de citoquinas. La alteración en su expresión podría tener significancia en cuanto a la capacidad de los bovinos infectados para la respuesta inmune frente a infecciones y vacunas. Existen datos de la bibliografía controvertidos respecto a la expresión de citoquinas en animales infectados que presentan o no linfocitosis persistente y/o linfosarcoma. Sin embargo, no está descripta dicha respuesta en relación a la carga proviral. El objetivo de este trabajo fue cuantificar la expresión de ARNm para IL-6, IL-10, IL-12, IFN-у y TNF-α en PBMC extraídos de vacas Holando Argentino no infectadas con el BLV (grupo control) e infectadas con ACPV o BCPV. A partir de muestras de sangre de 4 animales con ACPV, 4 con BCPV y 4 negativas a BLV, se separaron los PBMC mediante gradiente de Ficoll. Por un lado se conservaron células sin estímulo (ex vivo) y por otro lado se cultivaron in vitro durante 48hs PBMC en presencia de Concanavalina A (ConA). Los ensayos de expresión de ARNm de citoquinas se realizaron mediante cuantificación relativa por PCR en tiempo real, utilizando SybrGreen y amplificando GAPDH como gen endógeno. Los resultados se analizaron con REST© (Relative Expression Software Tool) 2009.Se evidenció que los PBMC de animales con ACPV, tanto estimulados con ConA como ex vivo, presentan mayor expresión de ARNm para IL-6 con respecto al control: 172 veces mayor en PBMC ex vivo (p=0,010) y 37 mayor en PBMC incubados con ConA (p=0,663). La expresión de los ARNm para las otras citoquinas resultó ser muy heterogénea, aunque no significativamente diferente entre grupos. En PBMC ex vivo de los animales con BCPV, con respecto al control, se evidenciaron diferencias de expresión en: TNF-α (se expresa 0,032 veces menos; p=0,012), IFN-γ (se expresa 0,044 veces menos; p=0,044), IL-10 (se expresa 0,067 veces menos; p=0,009) e IL-6 (se expresa 0,045 veces menos; p=0,005). En las células de los animales con BCPV estimulados con ConA, el TNF-α se expresa 0,026 veces menos (p=0,006), la IL-10 se expresa 0,0625 veces menos (p=0,011) y la IL-6 se expresa 0,0162 veces menos (p=0,02). Estos estudios preliminares muestran que los PBMC de los animales con ACPV tienen una expresión de citoquinas más heterogénea, tendiente a una mayor respuesta de tipo Th2, que los animales con BCPV. Sin embargo, los animales con BCPV mantendrían un perfil de expresión de citoquinas, tanto Th1 como Th2, similar al de los animales no infectados, aun existiendo diferencias significativas, evidenciándose una conducta más homogénea en relación al grupo control y dentro del mismo grupo.