Evaluación preliminar de un test de polarización de la fluorescencia en microplacas para el diagnóstico de la brucelosis porcina

Abstract

Los test serológicos constituyen herramientas esenciales para el diagnóstico y control de la brucelosis porcina. Las pruebas prescriptas por la OIE y el SENASA para esta especie, han sido desarrolladas para el diagnóstico en la especie bovina, y luego adaptadas para su uso en el porcino. Si bien permiten la identificación de piaras infectadas, ninguna de estas pruebas aisladas es útil en todas las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el diagnóstico de animales individuales.Las pruebas de referencia con fines de comercialización internacional son un ELISA indirecto y uno competitivo. La aglutinación con antígeno tamponado (BPA) y el test de Rosa de Bengala (RB) son pruebas alternativas con fines de detección o pruebas para el estudio de piaras completas1. La prueba de polarización de la fluorescencia ejecutada en tubos (FPAt) ha sido validada para el diagnóstico presuntivo de brucelosis porcina con una sensibilidad de 93,5% y una especificidad de 97,2%2. En ausencia de suero estándar internacional para brucelosis porcina, debe establecerse el umbral en la población de destino con técnicas de validación adecuadas1. La FPA resulta una técnica conveniente debido a su precisión, facilidad de ejecución y relativo bajo costo. El objetivo de este trabajo fue realizar una evaluación preliminar del ensayo de FPA en microplacas (FPAm) para el diagnóstico presuntivo de la brucelosis porcina.MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron 524 muestras de suero porcino de distintas categorías: 89 muestras provenientes de un establecimiento que presentó serología negativa a brucelosis en la totalidad del plantel en 2 muestreos anuales durante 7 años, y las restantes provenientes de 9 establecimientos con antecedentes clínicos o serológicos de la enfermedad. Las pruebas de BPA y FPA en tubo se realizaron e interpretaron de acuerdo a los procedimientos establecidos por SENASA. Para la variante de FPA en microplacas se probaron diferentes diluciones del suero porcino (1:25, 1:10 y 1:5) y se utilizó el kit para diagnóstico de brucelosis por FPA (Laboratorio Biológico de Tandil). La lectura de FPA se realizó con un lector multimodo de microplacas (DTX 880, BeckmanCoulter) y se expresó en unidades mP. Se analizaron 8 muestras en 8 ensayos independientes y se determinó la variabilidad interensayo. Se realizó un análisis ROC (receiver operator characteristic) para determinar el valor de corte del ensayo que maximice el índice de Youden (sensibilidad + especificidad -1).RESULTADOSLos mejores resultados se obtuvieron utilizando el suero porcino a la dilución 1:5. Los valores de mP obtenidos con la prueba en microplacas (dilución 1:5 del suero) fueron significativamente inferiores a los obtenidos con la prueba en tubo (dilución 1:25) para las muestras negativas (p< 0,0001), mientras que no se observaron diferencias significativas entre los 2 métodos para las muestras positivas (p> 0.05).La variabilidad interensayo medida para 8 muestras (3 negativas, 3 positivas y 2 positivas débiles) en 8 experimentos independientes fue de 11,1 ± 2,28 unidades mP, siendo el coeficiente de variación de 14% en promedio para las muestras analizadas.El análisis ROC realizado con los valores de mP obtenidos para 89 muestras de suero negativas y 74 muestras positivas a BPA y FPAt resultó en un valor de corte de 59,3 mP, con un índice de Youden de 0,914 (sensibilidad= 94,6% y especificidad= 96,6%).De 363 muestras de animales provenientes de piaras con antecedentes serológicos y/o clínicos de infección, categorizadas como negativas por BPA y FPAt, analizadas por FPAm, 328 (90,4%) dieron valores de mP por debajo del valor de corte establecido por el análisis ROC, mientras que 35 muestras (9,6%) resultaron con valores por encima de 59,3mP.DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓNLa validación de la prueba FPAt con gran cantidad de sueros porcinos provenientes de una región libre, estableció un valor de corte de 84mP2. Este valor ha sido adoptado por el SENASA para nuestro país3. En otro estudio4, utilizando la prueba en microplacas, se evaluaron sueros de distintas categorías epidemiológicas, incluyendo sueros con falsa reacción serológica positiva, y se encontró que el valor de 99,3mP fue el que mejor separó las poblaciones de infectados y no infectados. El valor de corte obtenido en este trabajo fue considerablemente inferior al establecido en otros estudios. Esto se debe, por un lado, a la dilución de suero utilizada. Además, el menor nivel de reacción observado en los sueros del establecimiento certificado negativo influyó directamente en el valor de corte obtenido en el análisis ROC. El mayor nivel de reactividad observado en los sueros categorizados como negativos por BPA y FPAt en establecimientos con antecedentes serológicos y/o clínicos de infección determinó una menor performance diagnóstica del FPAm en estas condiciones epidemiológicas.Es necesario analizar una mayor cantidad de sueros negativos de otros establecimientos, para definir un valor de corte. Se resalta la necesidad de establecer un rango de incertidumbre para la prueba en microplacas, y posiblemente también para la FPAt, tal como se considera en la especie bovina, para obtener una performance aceptable en las condiciones epidemiológicas de Argentina.Los autores agradecen al Laboratorio Biotandil S.R.L. los antígenos cedidos y el análisis de las muestras mediante la prueba de FPA en tubos.