Fundamentos de la cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico (HPAEc–PAD): Determinación estructural de glicoproteína

Abstract

Históricamente la purificación y el análisis de hidratos de carbono involucró el uso de técnicas como filtración en geles, cromatografía de afinidad (p. ej. lectinas) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En esta última técnica se utilizaron columnas de fase reversa con resinas alquílicas o fases amino para la separación de monosacáridos neutros y cromatografía de par iónico para oligosacáridos (Honda 1984, Hicks 1988; Huber & Bonn 1995). Las columnas de celite-carbón que habían sido utilizadas para la separación de hidratos de carbono no pudieron ser aplicadas en HPLC dado su fragilidad a la presión. Así, existen en el mercado numerosas columnas de HPLC aplicables al análisis de azúcares con diferentes grados de entrecruzamiento, diferentes formas iónicas y tamaños de partículas de las fases estacionarias y también de diferentes largos, aplicables a la separación de monosacáridos y oligosacáridos y que utilizan en general como fase móvil acetonitrilo: agua. Más recientemente, sistemas cromatográficos de interacción hidrofílica usando columnas basadas en empacados de fase unida a sílica con fases móviles de acetonitrilo: agua, también han sido utilizadas para la separación de hidratos de carbono. Sin embargo, este modo de HPLC puede tener desventajas como la inestabilidad y corto tiempo de vida de las fases unidad y la pobre selectividad y eficiencia de las columnas (Corradini et al., 2012).Debido a que los hidratos de carbono no absorben a longitudes de onda ultravioleta, el método de detección más utilizado es el índice de refracción. Si bien de esta forma se han podido separar oligosacáridos neutros, oligosacáridos que difieren en las ramificaciones y oligosacáridos conteniendo ácido siálico, no se logra la separación de oligosacáridos que difieran en el tipo de unión: por ejemplo Glcp(1-2)Glcp, Glcp(1-3)Glcp y Glcp(1-4)Glcp Otra metodología muy utilizada es la cromatografía gas-líquido, pero dado que los azúcares no son volátiles, exige una etapa previa de derivatización. (Reinhold, 1972; Laine et al., 1972) También se ha acoplado el uso de cromóforos o fluoróforos con el fin de aumentar la sensibilidad de detección (Muramoto et. al. 1987; Rosenfelder et al. 1985; Takemoto et al. 1985; Lin et al. 1985). Más recientemente existen en la literatura ejemplos de separaciones de hidratos de carbono que utilizan electroforesis capilar. Sin embargo, con el fin de mejorar las separaciones y facilitar el análisis de azúcares se desarrolló una técnica de HPLC que utiliza resinas básicas y eluyentes de alto pH (1-4) (Hardy et al., 1988). La separación se basa en la pequeña acidez que presentan los hidratos de carbono (Frahn et al., 1959) y se combina con un detector de pulso amperométrico que no requiere derivatizaciones y que permite la detección de los azúcares en el orden de pico y nanomoles (Rockin et al., 1983). Así en la figura 1 se observa una separación de monosacáridos y en la figura 2, la separación de oligosacáridos obtenidos por hidrólisis enzimática de fetuina. Nótese que aún dentro de cada grupo de oligosacáridos mono, di, tri y tetrasialilados, se distinguen especies que tienen diferencias solo en los tipos de unión y que se detectan como picos diferentes.