Western blot parcialmente desnaturalizante de Transtirretina en plasmas de portadores de la mutación V30M

Abstract

La transtirretina humana (TTR) es una proteína homotetramérica esencial para el transporte de tiroxina y retinol en individuos sanos. Mutaciones puntuales, particularmente substituciones de valina por metionina en posición 30 (V30M), desestabilizan los complejos de TTR y dan lugar a la liberación de monómeros (14 Kd, TTRm), responsables de la creación de depósitos amiloideos en el intersticio de tejidos cardiacos y cerebrales. El análisis en Western inmunoblot de plasmas humanos desnaturalizados por alta temperatura (95 C°, 10 minutos) en presencia del detergente iónico dodecyl sulfato de sodio (SDS) y utilizando anticuerpos monoclonales (Mabs) contra la molécula total o suero policlonal p71/98 dirigido contra la secuencia de aminoácidos 71 a 98 de TTR, detectan la presencia de TTRm, tanto en individuos positivos (portadores) como negativos para la mutación V30M. El suero policlonal p71/98 también identifica un polipéptido de 55-60 KD (TTRt) que corresponde a tetrámeros de TTR resistentes al tratamiento combinado de SDS y alta temperatura. El procesamiento de las muestras en presencia de SDS, pero a temperatura ambiente,(desnaturalización parcial) produce un notable incremento de TTRt y desaparición paralela de la banda correspondiente a TTRm en plasmas de individuos normales, pero no en plasma de portadores V30M-positivos, en los que TTRm continúa siendo claramente detectable. Los resultados sugieren que una simple modificación en el procesamiento de las muestras plasmáticas puede convertir al Western inmunoblot en una herramienta de utilidad para el screening de plasmas de portadores de ésta y otras mutaciones desestabilizantes de la estructura multimérica de TTR en el laboratorio clínico.

Human transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein essential for the transport of thyroxine and retinol in plasma of healthy individuals. Point mutations, mainly a substitution of valine to methionine at position 30 (V30M), result in disruption of TTR complexes and release of TTR monomers responsible for building amyloid deposits in the interstice of heart and brain tissues. Denaturing immunoblot analysis of plasma samples, with either monoclonal antibodies (MAbs) raised against the whole TTR molecule or with monospecific serum directed to the C-terminal track containing amino acid residues 71 to 98 (p71/98), readily identified the 14 Kd monomeric form of TTR in both V30M mutant-carrier and in non-carrier individuals. P71/98 also identified a 55-60 Kd polypeptide (TTRt) corresponding to a fraction of TTR tetramers that either escape disruption by the combined use of SDS and heat treatment and/or refolded during the first stages of PAGE/SDS running. A milder treatment avoiding the heating of plasma samples prior to immunoblot resulted in a notable increase in TTRt and disappearance of monomeric TTR in samples from V30M-negative individuals but not in those from V30M-positive carriers where free TTR monomers are systematically detected by p71/98 serum. Our results suggest that minimizing the TTR complex disruption before PAGE-SDS/ immunoblot analysis could be simple strategy to sort plasmas from V30M-positive and V30M-negative individuals in the clinical laboratory.