Primera detección molecular de Eimeria spp. y E. tenella en pollos infectados de Argentina

Abstract

Introducción: La coccidiosis es causada por los parásitos protozoos de los géneros Eimeria e Isospora y es una enfermedad de relevancia para los sistemas productivos intensivos como lo es la producción aviar (Constable 2016). En los pollos para carne los daños que produce son de mayor trascendencia cuanto mayor sea el animal, no sólo por las lesiones intestinales que ocasiona - las cuales varían según las especies infectantes y van desde exudados mucosos a hemorragias en distintos sectores del intestino delgado, ciegos y recto- sino porque el período de recuperación necesario no da lugar a que lleguen a la edad de sacrificio. Los síntomas varían según la especie infectante y pueden abarcar desde infecciones sub-clínicas y diarreas leves hasta severas, debido a la destrucción de la mucosa, a veces con sangre y coágulos (Daugschies 2005). La rápida propagación del parásito y la alta replicación produce severa contaminación ambiental y suele ser el foco de infección para los animales. Además, los ooquistes persisten en el ambiente por largos períodos y su eliminación es difícil (Fanatico 2006). En nuestro país el diagnóstico se realiza por examinación de materia fecal y observación de ooquistes de Eimeria sp. al microscopio y la determinación de la especie se realiza por morfometría del ooquiste, se considera el período de prepatencia de la enfermedad y se determina un puntaje a la lesión en las necropsias, ya que especies como E. tenella producen tiflitis hemorrágica y una notable dilatación de ambos ciegos de las aves afectadas. Si bien es una técnica económica y sencilla, es laboriosa y requiere de personal capacitado. Otra importante desventaja es la imposibilidad de detectar infecciones mixtas y de distinguir algunas especies de Eimeria, especialmente aquellas especies sub-clínicas, siendo las que ocasionan el mayor porcentaje del costo de producción dado que impactan en la ganancia de peso y en el índice de conversión alimenticia (De Gussem 2007). Por todo lo expuesto, la detección molecular de Eimeria contribuiría al control de la enfermedad, aportando a un diagnóstico más sensible y específico. Materiales y Métodos: A partir de los ciegos de pollos infectados, diagnosticados por microscopía, se realizó el aislamiento, esporulación y ruptura de ooquistes de E. tenella. La técnica se puso a punto utilizándose bolillas de vidrio y agitando vigorosamente en pulsos de 3 minutos a velocidad máxima, previo blanqueo con hipoclorito de sodio y lavado de los mismos. Se determinó el punto de corte mediante el cálculo del porcentaje de ruptura realizado por recuento directo de los ooquistes enteros, remanentes, al microscopio en cámara de Neubauer. Luego, para la puesta a punto de la extracción de ADN, se ensayaron 2 métodos: extracción con fenol/cloroformo/alcohol isomaílico (FCA) y resina Chelex 100 (Ch). Como control positivo se realizó la extracción de ADN mediante la utilización de un kit comercial a partir de una vacuna viva Livacox -utilizada en la producción aviar- que contiene las especies E. tenella, E. máxima y E. acervulina. PCR: Para la amplificación del ADN de Eimeria spp. se utilizaron cebadores de una región del gen de ARNr 18S de ~1800 pb y para E. tenella se usaron cebadores específicos de una secuencia caracterizada de una región amplificada (SCAR) de ~ 540 pb. Resultados: Se pusieron a punto las condiciones de amplificación tanto para la PCR del género Eimeria como para la específica de la especie E. tenella. A partir del recuento de ooquistes totales, de los cuales se extrajo el ADN y tomando en cuenta el volumen de elución del mismo, se calculó la cantidad de ooquistes agregados a cada reacción de PCR observándose reacción positiva con al menos 4 ooquistes/ul de reacción en ambos métodos de extracción.Fig. 1. Caracterización molecular de Eimeria. A. Amplificación por PCR del genero Eimeria, a partir de muestras aisladas del ciego de pollos infectados extraídas con FCA y Ch. B. Amplificación de E. tenella a partir de muestra extraída con FCA. (C+) Control positivo de ADN extraído a partir de la vacuna viva. (C-) Control negativo de reactivos.Discusión y Conclusión: En este trabajo, implementamos por primera vez en la Argentina el uso de técnicas moleculares para la detección del género Eimeria con una elevada sensibilidad. También se logró la detección de la especie E. tenella mediante la PCR específica. La introducción de estas técnicas permitirá mejorar el diagnóstico sobre todo en casos de coccidiosis subclínicas, y también el estudio de las diferentes especies incluso en muestras con baja cantidad de parásitos sin la necesidad de realizar la necropsia de los animales. Esto contribuye al desarrollo de estrategias de control y prevención. Asimismo, la utilización de estas técnicas posibilitará el estudio de la epidemiología molecular de las especies circulantes, ayudando a complementar el estudio de la enfermedad para el desarrollo a futuro de nuevas vacunas.