Efecto antibacteriano de colicinas sobre Escherichia coli O157:H7

Abstract

Las colicinas son péptidos con actividad antimicrobiana, sintetizados por Escherichia coli. Se producen en condiciones de estrés, como estrategia de competencia intraespecífica, al actuar sobre bacterias filogenéticamente relacionadas. Están codificadas en el genoma bacteriano o en plásmidos, actúan de diversas maneras sobre las células diana, por ejemplo, inhibiendo la replicación de ADN o despolarizando la membrana plasmática al insertarse y formar poros en ella. La actividad antibacteriana de las colicinas, las convierte en potenciales herramientas en el control de bacterias transmitidas por alimentos, como E coli productora de toxina Shiga (STEC). Estos patógenos son productores de enfermedades severas como la colitis hemorrágica y el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), endémico de Argentina, afectando principalmente a niños de corta edad. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana de dos cepas de E. coli (24-7 y 27-4) aisladas de colon bovino e identificadas por PCR como colicinogénicas para las colicinas B, M, H47, e Ia, E7, B, respectivamente.Métodos: Se cultivaron las cepas colicinogénicas (col) y O157:H7 en medio Luria Bertani (LB) a 37°C en agitación por 24h (ON). Los cultivos col fueron centrifugados a 12000 rpm durante 15 min y los sobrenadantes fueron clarificados mediante filtros de jeringa de 0.22 µm. Se obtuvieron de esta manera sobrenadantes libres de células (SLC) y se probó su efecto inhibitorio, puros o en diluciones seriadas al medio, utilizando LB, colocando 100 µl de SLC en placas de 96 pocillos, sembradas con 103 UFC/ml de una cepa O157:H7. Se incubaron las placas a 37°C, se midió la densidad óptica (DO) a 495 nm a distintos tiempos; y graficó la DO495/tiempo. En paralelo, se realizaron siembras en placas de LB agar de las suspensiones bacterianas enfrentadas a las colicinas, y se incubaron a 37°C ON para obtener el recuento de viables y realizar la curva UFC/ml. Posteriormente, se extrajo el ADN de las cepas col mediante Wizard genomic DNA purification kit (PROMEGA) remitiéndose a la empresa MicrobesNG (Birmingham, Reino Unido), donde se realizó la secuenciación genómica con una cobertura de 30x. Las secuencias obtenidas fueron analizadas para el minado de colicinas mediante la plataforma BAGEL4. Resultados: Las curvas de crecimiento por DO y recuento en placa demostraron que una de las cepas col (27-4) posee actividad bactericida, manteniéndose en todas las diluciones empleadas; mientras que la otra (24-7) posee actividad bacteriostática que persistió en todas las diluciones, pero proporcional a la dilución empleada. La secuenciación genómica de las cepas col demostraron que estas codifican para colicinas. Se pudo confirmar la presencia de las colicinas: Ia, B, V, M y E7, codificadas por la cepa 27-4 y las colicinas: Ia, B, M, V, E1 y la microcina H47 en la cepa 24-7, identificadas previamente por PCR.Conclusión: Estos resultados, demuestran que las colicinas son potentes agentes inhibidores del crecimiento de E. coli O157:H7 y son una alternativa de posible aplicación para prevenir la contaminación bacteriana o reducir la carga de estos en alimentos.