Comparación de dos métodos simples de criopreservación de semen porcino: Efectos en parámetros de calidad seminal

Abstract

Cerca del 40% de la carne roja que se consume en el mundo es provista por los cerdos. Los productores porcinos de nuestro país se encuentran ante el enorme desafío de lograr mejoras productivas con un desarrollo económico sustentable y eficiente, así como implementar tecnologías reproductivas, como la inseminación artificial y la criopreservación de semen. Tales adelantos aún presentan enormes problemas en estaespecie. El objetivo de este trabajo fue comparar dos métodos simples de congelamiento para semen porcino, evaluando los parámetros de calidad seminal al momento del descongelado. Las muestras de semen fueron criopreservadas en pajuelas siguiendo el protocolo descripto por Peña y colaboradores en 2003, realizando (grupo tratamiento) o no (grupo control) una modificación en el paso final de congelamiento posterior al envasado en las pajuelas. Las evaluaciones de motilidad y vitalidad se realizaron por microscopía óptica en platina termostatizada y por las técnicas de eosina/nigrosina y la combinación del colorante supravital azul tripán con microscopía de contraste interferencial diferencial, respectivamente. La criocapacitación se evaluó por la técnica fluorescente de clorotetraciclina (CTC). Los resultados de los diferentes experimentos fueron analizados por la prueba t de Student. Las muestras del grupo tratamiento evidenciaron una motilidad significativamente más alta (p<0,05) y una criocapacitación significativamente más baja (p<0,05) que la del grupo control. El porcentaje de espermatozoides vivos en las muestras del grupo tratamiento (33±3) resultó el doble que el del grupo control (16±2). Nuestros resultados demuestran que el método de congelamiento propuesto permite obtener, al descongelado, muestras de una mayor calidad que las obtenidas al descongelar muestras que hayan sido congeladas con el método tradicional.

About 40% of red meat consumed around the world is porcine meat. Argentinean producers face the big challenge of achieving productive improvements with efficient and sustainable economic development and reproductive technologies, like artificial insemination and sperm cryopreservation (that still has many problems in this specie), seems to be an essential element for achieving them. The aim of this work was to compare two different simple cryopreservation methods for porcine sperm, evaluating sperm quality parameters at the moment of thawing. Sperm samples were cryopreserved following Peña et al. protocol (2003), performing (treatment group) or not (control group) a modification during the final step of cryopreservation after the straws’ packing. Sperm motility and viability of ejaculated and thawed sperm were evaluated by optic microscopy with thermal stage and the combination of the blue trypan supravital technique and differential interferential contrast microscopy, respectively. Cryocapacitation was evaluated by the chlortetracycline technique (CTC). The results of the different experiments were analyzed by t-student test. The samples of the treatment group showed a significantly higher (p<0.05) sperm motility and a significantly lower (p<0.05) cryocapacitation than the control group. The percentage of live spermatozoa in samples of the treatment group (33±3) doubled those in the control group (16±2). Our results demonstrate that the proposed method of cryopreser- 24 INTRODUCCIÓN La carne de cerdo representa hoy cerca del 40% de la carne roja que se consume en el mundo, proyectándose a nivel mundial un consumo de 15,3 kg/habitante/ año para el 2030 12 . En los últimos años, en nuestro país se ha incrementado sustancialmente su consumo, llegando en 2015 a unos 11,30 kg/habitante/año 10 . En tal sentido, los productores porcinos se encuentran ante el enorme desafío de lograr mejoras productivas con un desarrollo económico sustentable y eficiente 15 . La implementación de tecnologías reproductivas resulta un componente esencial para lograr un buen posicionamiento productivo 16 . La inseminación artificial (IA) es la técnica más importante para el mejoramiento genético de los animales y es una práctica corriente en los principales países productores de cerdos, sustituyendo prácticamente a la monta natural con niveles superiores al 90% en Europa y en EEUU. En Sudamérica se ha registrado un importante avance en los últimos años, llegando a casi 100% en Chile y 66% en Brasil 9 . En nuestro país las situación es diferente. Si bien los niveles de producción se han incrementado en un 160% en la última década 10 , el uso de la IA no ha seguido el mismo camino, mostrando aún bajos niveles de utilización. En Argentina, la utilización de esta técnica presenta un problema relacionado con el tiempo de conservación de los espermatozoides, que es de aproximadamente una semana para el semen refrigerado y que llevaría a problemas en el transporte de las dosis seminales debido a lo extenso de nuestro territorio. Una posible solución a este inconveniente se encuentra en otra biotecnología muy asociada a la IA, que es la criopreservación de semen. A diferencia de lo que ocurre en otras especies pecuarias como el bovino, a nivel mundial la IA en porcinos con semen congelado, sólo se utiliza con fines experimentales, para intercambio de material genético entre países o conservación de germoplasma de altísimo mérito genético, debido a la disminución en las dosis procesadas, la fertilidad y el tamaño de la camada 6, 7, 20 . Algunos investigadores indican que durante el congelamiento y descongelamien-to, los espermatozoides del porcino presentan cambios en la concentración y distribución de transportadores de glucosa, como el GLUT-3, en su membrana celular 1 . Su disminución podría explicar la corta viabilidad, alrededor de cuatro horas, de los espermatozoides descongelados del cerdo. Además la membrana plasmática del espermatozoide porcino tiene escasa resistencia al proceso de congelación-descongelación debido a su mayor concentración de fosfolípidos insaturados 2 . Las inseminaciones utilizando espermatozoides congelados/descongelados resultan en bajas tasas de preñez y escaso tamaño de las camadas, comparadas con las obtenidas con semen fresco o refrigerado 3 . Aún cuando la utilización de la inseminación intrauterina junto con la inseminación a tiempo fijo han permitido obtener mejores resultados 8 , la incorporación de esta biotecnología para el desarrollo productivocomercial se encuentra claramente limitada. La utilización de semen criopreservado no sólo tendría efectos a nivel productivo, como en la introducción de nueva genética, sino también a nivel sanitario 6 . De allí surge la importancia de posicionar no sólo el uso de la IA en porcinos en nuestro país sino también a la criopreservación de semen, como una tecnología de uso corriente en esta especie. El objetivo de este trabajo fue comparar dos métodos de congelamiento para semen porcino, evaluando los parámetros de calidad seminal al momento del descongelado. MATERIAL Y MÉTODOS Obtención de las muestras de semen. Las mismas se recolectaron por la técnica de mano enguantada de 4 porcinos jóvenes mestizos (Yorkshire x Pietrain), de probada fertilidad. Los animales utilizados pertenecían a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires, presentaban un estado corporal y sanitario óptimo y fueron mantenidos bajo condiciones uniformes de manejo y alimentación durante el tiempo que duró el estudio. Fueron congelados todos los eyaculados que presentaron un mínimo de 70% de espermatozoides móviles y un 80% de espermatozoides con morfología normal. Congelamiento de las muestras de semen. Ellas fueron criopreservadas en pajuelas siguiendo un protocolo convencional 13 , realizando (grupo tratamiento) o no (grupo control) una modificación en el paso final de congelamiento posterior al envasado en las pajuelas. En forma resumida, las muestras a congelar se diluyeron a:a en medio Beltsville Thawing Solution (BTS) antes de pasar por un período de enfriamiento en dos etapas: primero a temperatura ambiente hasta los 25°C y luego, en heladera hasta los 15°C. El período de estabilización se llevó a cabo a esta temperatura durante 2 horas. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 300G por 3 min, descartando el plasma seminal. El precipitado se re-suspendió en diluyente de enfriamiento (lactosa, yema de huevo, penicilina y estreptomicina) previamente a la realización de una curva de enfriavation allows obtaining, at thawing, higher quality sperm samples than the ones obtained with the traditional method of cryopreservation.