Estrategias reproductivas de moluscos gasterópodos: Caracterización bioquímica y toxicidad de los huevos de Pomacea maculata (Caenogastropoda: Ampullariidae)

Abstract

Pomacea maculata (Gastropoda: Ampullariidae) es un caracol dulceacuícola nativo deSudamérica que ha sido introducido en el sudeste asiático, Europa e islas del Océano Pacífico dondese ha convertido en una seria plaga para la agricultura, principalmente en cultivos de arroz y taro.Estos organismos representan también un riesgo sanitario importante como hospedadoresintermediarios de varios parásitos, como el nematode Angiostrongylus cantonensis, agente causal deuna meningoencefalitis eosinofílica humana. Su introducción en nuevas áreas también ha generado ungran impacto ecológico en los sistemas acuáticos invadidos. Además de la demanda de conocimientoen busca de soluciones para los problemas antes mencionados, otras características llamativas de losampuláridos han despertado el interés para la investigación de su biología. En particular, su inusualmodo de vida anfibio despierta interrogantes acerca del origen de novedosas adaptaciones anatómicasy comportamentales, en ocasiones únicas, como la presencia de un doble sistema respiratorio y laestrategia reproductiva de oviposición aérea. Así, en el proceso de oviposición, las hembras del géneroPomacea, depositan sus huevos fuera del agua en masas calcáreas que quedan expuestas a lascondiciones severas del ambiente aéreo como la elevada radiación solar y la temperatura, ladesecación y los depredadores terrestres. A pesar de ello, sus embriones se desarrollan y eclosionannormalmente. Este hecho llevó a suponer la existencia en el huevo de algún sistema de protecciónefectivo contra los factores ambientales antes mencionados que además logra disuadir a los potencialesdepredadores. Apoyando esta hipótesis, y contrariamente a lo esperable, se han registrado muy pocoscasos de depredación en condiciones naturales. De hecho, esta estrategia reproductiva inusual dentrode los ampuláridos, ha sido considerada una característica clave para el éxito evolutivo del géneroPomacea, el clado más especioso y más ampliamente distribuido de los ampuláridos.En los ampuláridos, como en la mayor parte de los gasterópodos, el vitelo tiene escasodesarrollo y en su lugar, el embrión está rodeado de un fluido perivitelino (FPV), que constituye laprincipal fuente nutricia para el embrión. Además, el FPV de Pomacea, tiene funciones de proteccióncontra los factores bióticos y abióticos arriba mencionados. En particular varias de sus proteínas(perivitelinas) han mostrado propiedades fotoprotectoras, antioxidantes, antinutritivas (no digeribles),antidigestivas (inhibición de la digestión) y neurotóxicas; asimismo proveen al huevo de unacoloración muy llamativa, considerada de advertencia (aposemática). Así, las perivitelinas conformanun sistema de defensa efectivo que explicaría la viabilidad de los huevos en el hostil ambiente aéreo.La inmensa mayoría de los estudios arriba mencionados, han sido realizados en la especie P.canaliculata desconociéndose la composición y propiedades de los huevos de otros ampuláridos.Contar con esta información permitiría establecer comparaciones evolutivas sobre el rol de losmecanismos defensivos en la estrategia reproductiva, y ayudaría a comprender la importancia de laoviposición aérea en la diversificación y dispersión del género Pomacea.En este contexto, el objetivo general del presente trabajo de Tesis Doctoral es contribuir alentendimiento de la biología reproductiva de los moluscos gasterópodos del género Pomacea,aportando al conocimiento acerca de los mecanismos de defensa de los huevos de la especie P.maculata. En particular se pretende obtener información detallada de los componentes de los huevosde esta especie y de la presencia de las defensas bioquímicas que han sido encontradas en otrosampuláridos, o bien de nuevos mecanismos defensivos. Asimismo, se pretende caracterizar estructuraly funcionalmente a la PmPV2, la perivitelina ortóloga a la neurotoxina de P. canaliculata (PcPV2), asícomo estudiar su mecanismo de acción e interacción con membranas, evaluar su capacidad paraingresar a un potencial depredador, y determinar su capacidad enterotóxica.En primer lugar, analizamos los huevos de P. maculata estudiando su composición general,toxicidad, su actividad hemaglutinante, y sus propiedades antinutritivas y antidigestivas. Observamosque están compuestos mayormente por polisacáridos y proteínas (perivitelinas), seguidos porcantidades menores de lípidos y calcio no soluble. El polisacárido de reserva identificado fue elgalactógeno, un polisacárido exclusivo de la reproducción de la mayoría de los gasterópodos. Dosperivitelinas denominadas PmPV1 y PmPV2, se acumulan masivamente y representan el ~85 % de lamasa seca de las proteínas totales. Los lípidos más abundantes corresponden a fosfolípidos ycolesterol. Entre los compuestos inorgánicos, el calcio fue el ión más abundante, relacionado con lapresencia de una cubierta calcárea que rodea y protege a los huevos de esta especie. Se identificaronuna gran variedad de potenciales defensas contra factores bióticos particularmente una potenteactividad tóxica, actividades antidigestivas y antinutritivas y una moderada actividad lectina. Lainyección i.p. en ratones del FPV de esta especie generó síntomas neurológicos semejantes a losreportados para la PcPV2 de P. canaliculata, sugiriendo la presencia de una toxina semejante. Sedeterminó también la presencia de inhibidores de proteasas que podrían actuar como un sistema dedefensa tanto contra patógenos como contra depredadores (antidigestión). Notoriamente, demostramosque el galactógeno es refractario a la digestión in vitro por glicosidasas digestivas, siendo esta laprimer evidencia de un polisacárido de reserva con una posible función de defensa antinutritiva. Enconclusión, hemos caracterizado detalladamente el ~99 % de la composición de los huevos y hemosidentificado múltiples defensas potenciales, provistas no sólo por las proteínas sino que también por elgalactógeno. Presentamos la primer evidencia, según nuestro conocimiento, de que los azúcares dereserva pueden estar involucrados en defensas anti-depredación, y esto brindaría la primer explicaciónde su amplia distribución en los huevos de gasterópodos, aportando asimismo nueva informaciónsobre la estrategia reproductiva inusual de Pomacea.En segundo lugar, demostramos que la actividad tóxica de los huevos de P. maculata esdebida a una proteína de c.a. 400 kDa, la PmPV2, que es ortóloga a la PcPV2 de P. canaliculata.Demostramos parte de su mecanismo de acción, observando que esta proteína multimérica formaporos con forma de anillo en las células intestinales, alterando la permeabilidad de su membrana yllevando a una muerte celular rápida. La PmPV2 es, por tanto, un miembro de las toxinas formadorasde poros (PFT). Combina dos proteínas ancestrales del sistema inmune: una lectina con estructura deβ-propeller unida por puente disulfuro a una proteína de la superfamilia de las citolisinas dependientesde colesterol - proteínas del complejo de ataque a membrana/perforina (CDC/MACPF). Estaestructura dimérica recuerda a las ?toxinas-AB? descriptas en bacterias y plantas, mientras que enanimales sólo se había descripto en los huevos de P. canaliculata (toxina PcPV2). En este trabajoobservamos que el dominio MACPF se encuentra fusionado con un novedoso dominio accesorio,presente exclusivamente en los invertebrados, que podría intervenir en la unión de la toxina a lamembrana de la célula blanco, al que denominamos IMAD. Estudiamos luego la interacción de laPmPV2 con membranas y observamos que se une a un receptor glicoproteico mediante la subunidadlectina (módulo ?B? de delivery) e interacciona fuertemente con el colesterol de la bicapa lipídica parapenetrar la membrana plasmática por medio de la subunidad MACPF (módulo ?A? tóxico). Más aún,demostramos que la unión del módulo B es necesaria para la acción citotóxica de la PmPV2. Losresultados obtenidos en esta parte del presente trabajo de Tesis Doctoral ubican a las PV2s como lasprimeras PFT descriptas en moluscos y las únicas PFT acumuladas dentro de huevos reportadas hastala fecha. Se brindan asimismo las primeras evidencias acerca del mecanismo de reconocimiento demembrana y formación de un poro para una PFT de toda la familia MACPF.Finalmente, analizamos la capacidad de la toxina PmPV2 de resistir la digestióngastrointestinal, su interacción con el sistema digestivo y su capacidad de generar una respuestainmune adaptativa, utilizando ratones como animales modelo. Observamos que la PmPV2 tolera elpaso por el sistema gastrointestinal y llega al intestino de forma activa. Demostramos que luego se unea los enterocitos modificando la morfología intestinal para finalmente disminuir la superficie absortivade su mucosa en menos de 48 h. Observamos también que la PmPV2 es citotóxica para las célulasintestinales, y altera la permeabilidad de una monocapa de estas células, estableciendo una posible víade entrada a través del epitelio. Marcando la toxina fluorescentemente vimos que es captada in vivopor las células de las placas de Peyer del intestino delgado, indicando otra nueva vía de ingreso alsistema. Independientemente del camino que sigue la PmPV2 para atravesar la barrera intestinal,observamos que la administración oral de esta toxina genera una respuesta inmune adaptativa enratones produciendo anticuerpos IgG detectados en circulación y capaz de neutralizar el efectoneurotóxico de la misma. Los resultados de esta parte del trabajo de Tesis brindan la primera evidenciade la/s forma de ingreso a un depredador y sobre todo de que la PmPV2, además de ser unaneurotoxina, presentaría una importante actividad enterotóxica, pudiendo ser ésta una de las causas delcomportamiento de evasión por parte de los depredadores.En conjunto, los resultados del presente trabajo de Tesis Doctoral indican que los huevos de P.maculata presentan un sistema de defensa bioquímico complejo para repeler a un potencialdepredador, integrando diversos mecanismos defensivos mediante proteínas y azúcares que a la vezsirven de nutrientes para el embrión en desarrollo. Este efectivo sistema defensivo de las especies dePomacea permitiría explicar la escasez de depredadores de sus huevos.Finalmente, cabe destacar que el descubrimiento de mecanismos de acción novedosos enmoléculas bioactivas aumenta el acervo de herramientas potencialmente aplicables en biotecnología ybiomedicina.

Pomacea maculata (Gastropoda: Ampullariidae) is a species of freshwater snails native from South America that has been introduced into South East Asia, Europe and the Pacific Islands where they had become serious agricultural pests, notably in rice and taro crops. These organisms also represent an important sanitary risk since they are host for several parasites such as the nematode Angiostrongylus cantonensis, which causes a human eosinophilic meningitis. In their invaded areas, it has also caused great ecological impact on wetlands. In addition to the need for studies bringing solutions to the problems above mentioned, another remarkable characteristics of ampullariids have awakened interest in the research of their biology. In particular, the origin of novel anatomic and behavioral adaptations to their amphibious lifestyle, such as the presence of a double respiratory system and the reproductive strategy of aerial oviposition, are intriguing. In the oviposition process, adult females from the genus Pomacea lay their eggs above the waterline in calcareous masses. Therefore, these eggs are exposed to the harsh conditions of the aerial environment such as sun radiation, high temperatures, desiccation and terrestrial predators. Nonetheless, their embryos develop and hatch normally. This fact leads to consider the existence of an effective egg protective system against the environmental factors and against potential predators. Supporting this hypothesis, and contrary to what was expected, very few cases of predation of these eggs have been reported in nature. In fact, this unusual reproductive strategy for an aquatic organism has been considered a key characteristic for the evolutionary success of the Pomacea genus, which is the most specious and widely distributed of the whole Family. As in most gastropods, ampullariids have a reduced vitellus and instead, the embryo is surrounded by a perivitelline fluid (PVF), which is the main nutrient source during embryogenesis. Besides, the PVF from Pomacea species has protective functions against biotic and abiotic factors. For instance, several of its proteins (pevitellins) have photoprotective, antioxidant, antinutritive (indigestible), antidigestive (digestion inhibition) and neurotoxic properties; they also provide to the eggs with a bright coloration which is considered a warning signal (aposematic). As a whole, perivitellins conform an effective defensive system that explains the high viability of the eggs in the harsh aerial environment. Most of the studies mentioned above have been performed in the species P. canaliculata, while the composition and properties of the eggs or their perivitellins from other ampullariids is unknown. Having this information would allow evolutionary comparisons on the role of the defensive mechanisms in the reproductive strategy of this snails and would help to understand the importance of the aerial oviposition in the diversification and spread of the Pomacea genus. In this context, the general aim of this PhD thesis is to contribute to the understanding of the reproductive biology of the gastropod mollusks of the Pomacea genus, expanding the knowledge regarding the egg defense mechanisms of P. maculata. In particular, to obtain detailed information of the egg components and of the presence of the biochemical defenses found in other ampullariids, orthe description of new defensive mechanisms. Besides, we aim to characterize structurally and functionally the protein PmPV2, which is an orthologous perivitellin to the P. canaliculata neurotoxin (PcPV2), as well as study its mechanism of toxicity, including membrane interaction, capacity to enter into a potential predator, and putative enterotoxic capacity. First, we studied the general composition, toxicity, hemagglutinating activity, and antinutritive and antidigestive properties of P. maculata eggs. We found that they are mainly composed of polysaccharides and proteins (perivitellins), followed by lesser amounts of lipids and non-soluble calcium. We identified the storage polysaccharide of the eggs as galactogen, a polysaccharide exclusive of the reproduction of most gastropods. Two perivitellins called PmPV1 and PmPV2, are massively accumulated and represent ~85 % of the total protein dry matter. The mayor lipid classes are phospholipids and cholesterol. Among inorganic components, calcium was the major ion, related with the presence of a calcareous capsule that surrounds and protects the eggs of this species. A wide variety of putative defenses against biotic factors were identified, including a strong toxic activity, antidigestive and antinutritive activities and a mild lectin activity. Mice injected i.p. with PVF of this species show neurological symptoms that resemble those reported for the PcPV2 from P. canaliculata, indicating the presence of a similar toxin. The presence of protease inhibitors was also detected, which could be acting as a defense system against pathogens or predators (antidigestive). Remarkably, we demonstrate that the galactogen is refractory to in vitro digestion by digestive glycosidases, this being the first evidence of a storage polysaccharide with a putative function in an antinutritive defense. In conclusion, we have characterized in detail ~99 % of the whole composition of the eggs and we have identified multiple putative defenses, not only provided by proteins but also by the galactogen. We present the first evidence, to the best of our knowledge, that storage sugars may be involved in antipredator defenses providing the first explanation of its spread among gastropod eggs instead of glycogen, contributing at the same time with new information regarding the unusual reproductive strategy of Pomacea. We also determined that the toxic activity of P. maculata eggs is due to a 400-kDa protein, PmPV2, which is orthologous to PcPV2 from P. canaliculata eggs. We demonstrated part of its mechanism of action, where this multimeric protein forms ring-like pores in intestinal cells, altering the membrane permeability and leading to a fast cell death. PmPV2 is, therefore, a member of the pore-forming toxins (PFT), which combine two ancestral proteins from the immune system: a lectin with a β-propeller structure joined by disulfides to a protein from the Cholesterol Dependent Cytolysins - Membrane Attack Complex/Perforin (CDC/MACPF) superfamily. This dimeric structure resembles that of the “AB-toxins” reported for bacteria and plants, and in animals only described in the eggs of P. canaliculata (PcPV2 toxin). In this PhD thesis we observed that the MACPF domain is fused with a novel ancillary domain that we called IMAD, which is exclusive of invertebrate MACPFs and could be involved in the toxin binding to the membrane of the target cell. Then, we studied the interaction of PmPV2 with membranes and observed that it binds to a glycoprotein receptor through the lectin subunit (delivery “B” moiety) and strongly interacts with cholesterol from the lipid bilayer to penetrate the plasma membrane through the MACPF subunit (toxic “A” moiety). Furthermore, we demonstrate that the binding of the B moiety is necessary for the cytotoxic activity of PmPV2. The results here obtained locate the PV2s as the first reported PFTs in mollusks and the only ones to be stored inside the eggs until date. Likewise, we provide the first evidence regarding the membrane recognition and pore formation mechanisms for a PFT from the whole MACPF family. Finally, we analyzed the capacity of PmPV2 to resist gastrointestinal digestion, its interaction with the digestive system and its capacity to generate an adaptive immune response using mice as model animals. We found that the PmPV2 withstands gastrointestinal digestion and reaches the intestine in an active form. Once in the intestine, we showed that it binds to the enterocytes, and modifies the intestinal morphology diminishing the absorptive surface in less than 48 h. We also found that PmPV2 is cytotoxic for intestinal cells and alters the permeability of a monolayer of these cells, establishing a putative way of entrance through the epithelial layer. Fluorescently-labeled toxin was detected in vivo in cells from the Peyer’s patches of rodents, indicating another way of entrance into the circulatory system. Regardless the way that PmPV2 traverses the intestinal barrier, we found that mice orally administered with the toxin generates an adaptive immune response, producing circulating IgG antibodies and neutralizing its neurotoxic effects. These results provide the first evidences of the way/s of entrance of the toxin and most important that the PmPV2 is the first neurotoxin with an important enterotoxic activity. This dual toxic capacity could help explain the eggs avoidance behavior of predators. As a whole, the results from this PhD thesis work indicate that P. maculata eggs present a complex and effective biochemical defense system to repel putative predators, integrating several defensive mechanisms of proteins and sugars that, at the same time, act as a nutrient source for embryo. This efficient defensive system found in Pomacea species would explain the scarcity of predators for their eggs. Finally, it should be noted that the discovery of novel mechanisms of action of bioactive molecules increases the set of tools potentially useful in biotechnology and biomedicine.