Sistemas de monocapas y bicapas aplicados al estudio de la estabilidad dinámica estructural y microheterogeneidad de membranas de mielina purificada

Abstract

Este proyecto profundiza en el estudio de arreglos de membrana de mielina purificada (MMPs). A lo largo de la tesis se compararon las propiedades biofísicas de los diferentes tipos de patrones de separación de fases en monocapas y bicapas de mielina, bajo la influencia de variables ambientales y composicionales. Además, se establecieron correlaciones entre los distintos arreglos de membrana y se construyeron diagramas de fases en función de la temperatura y la fuerza iónica. Inicialmente se muestran resultados vinculados al estudio de propiedades físicas de las monocapas de mielina bajo diferentes condiciones iónicas. A partir de estudios previos realizados en nuestro laboratorio, ya conocíamos mediante análisis de microscopía de fluorescencia en interfase aire/agua, microscopía de ángulo de Brewster (BAM, por Brewster Angle Microscopy) e inmuno-marcación de films de Langmuir-Blodgett, que las monocapas de mielina presentan dos fases: una líquido-ordenada (LO) enriquecida en colesterol, fosfolípidos y cerebrósidos, y otra fase liquido-expandida (LE) que captura la mayoría de las proteínas y gran parte de los lípidos líquido expandidos. Se analizó la estructuración topográfica de las monocapas de mielina en tres condiciones iónicas: baja fuerza iónica (buffer Tris 5 mM a pH 7.4), solución fisiológica y alta concentración de CaCl2 (20 mM). En todos los casos se observó que la mielina posee dos fases en gran parte del rango de presiones de superficie (π) analizado (5-35 mN/m). El patrón observado es muy similar para las diferentes subfases, observándose una pérdida de contraste alrededor de 10-15 mN, y una posterior reversión en la reflectividad para ambas fases a presiones de superficie mayores. La principal diferencia observada es que en la subfase acuosa de baja fuerza iónica y a altas presiones (entre 37 y 40 mN/M), los bordes de los dominios se tornan irregulares y la monocapa se homogeniza. Desde allí se observa una única fase. En cambio, en presencia de sales, las dos fases permanecen a lo largo de todo el rango de presiones. Con medidas ópticas de reflectividad (R) de las monocapas sobre subfases de índice de refracción conocido y controlado se determinaron los índices de refracción de mielina y su fracción lipídica en distintas condiciones de empaquetamiento lateral. Los resultados indican que existe una constancia del índice de refracción con la compresión desde el estado gaseoso al colapsado. Para el caso particular de lípidos de mielina se corroboró la correspondencia entre el índice de refracción de bicapas (unilamelares) en suspensión y monocapas en interfase aire/agua (1).Conociendo el índice de refracción de las monocapas y su reflectividad se calculó el grosor de las mismas. Para ello se combinó la información de los índices de refracción de cada fase y su reflectividad, lo que permitió realizar curvas de grosor en función del área molecular para cada una de las fases presentes en mielina. Los resultados fueron validados empleando dos técnicas diferentes de dispersión de rayos X: Dispersión de rayos X a ángulo rasante fuera del plano especular (GIXOS, por Grazing Incidence X-ray Off Specular Scattering) y Dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS, por Small Angle X-ray Scattering). La conjunción de los datos de SAXS en bicapas y GIXOS en monocapas permitió obtener una definición integral del espesor medido por BAM, que no incluye solo las cadenas hidrocarbonadas sino también la región polar. En términos generales, para monocapas de mielina total se observó que la fase LE experimenta un cambio de grosor mucho más grande que la fase LO a lo largo del rango de presiones de superficie medido. En particular, a altas presiones, la fase LE es considerablemente más gruesa que la fase LO. En el segundo capítulo de resultados se muestran mediciones de diferentes parámetros que permiten explicar la estabilidad de las fases y la distribución de dominios en una determinada condición. La tensión de línea (λ), definida como la energía por unidad de perímetro entre dominios, tiende a incrementarse ante la presencia de altas concentraciones de CaCl2, lo que lleva a pensar que el calcio es un ion que favorece la estabilización del sistema bifásico. Por otro lado, también se vio que existe una proporcionalidad entre la diferencia de grosor de las fases y la tensión de línea, alcanzando ésta valores mínimos en las regiones próximas a un punto de miscibilidad. Es decir, también las diferencias de grosor se muestran como un factor estabilizante de la separación de fases. A partir de medidas de repulsión dipolar (µ^2) y tensión de línea se calcularon radios de equilibrio (R_eq) de acuerdo al modelo propuesto por McConnell y se pudo comprobar que dicho modelo solamente arroja resultados válidos en las regiones cercanas a puntos de miscibilidad. La separación de fases en sistemas de multicapas de mielina fue analizada en el tercer capítulo de resultados mediante técnicas de difracción de rayos X y neutrones. Debido a la naturaleza multilamelar de la mielina, las técnicas de difracción nos dan información acerca de la estructuración vertical de la misma, a partir de la cual puede inferirse si existe o no coexistencia de fases a nivel lateral. Se realizaron experimentos en distintas condiciones de fuerza iónica y temperatura. En términos generales se vio que las MMPs muestran separación de fases inducida por la presencia de sales en el medio y por el enfriamiento. Con baja fuerza iónica o buffer fisiológico la mielina presenta una única fase a 37 °C, que llamamos nativa. Al disminuir la temperatura entre 10 y 20 °C, el pico nativo se desdobla en dos fases: una de las fases presenta el espaciamiento propio de la membrana natural y la otra fase es más expandida en sentido transversal a las capas. Por el contrario, en presencia de alta concentración de Ca2+ también hay dos fases presentes pero la fase no nativa es más compacta que la nativa. Además, la fase no nativa está presente incluso a altas temperaturas (hasta 60 °C), confirmando la idea de que el calcio es un ion fuertemente estabilizante de la separación de fases. Los resultados obtenidos por SAXS y difracción de neutrones coinciden a pesar de que en ambas medidas se emplearon arreglos multilamelares diferentes. Con el propósito de echar luz sobre la composición de las fases presentes, se aislaron subfracciones de mielina insolubles en detergente a baja temperatura (4 °C) y composicionalmente enriquecidas en colesterol, esfingolípidos y algunas proteínas ancladas por GPI. Las similitudes notables que surgieron en términos de estructura y comportamiento colectivo entre las fracciones insolubles en detergente y las fases no nativas de MMPs inducen a pensar que las dos membranas tienen una constitución muy similar.Finalmente, en el último capítulo de resultados se muestra un estudio sistemático realizado mediante SAXS que tiene como finalidad conocer el comportamiento de fase de las MMPs a lo largo de un rango amplio de fuerza iónica y temperatura. A partir de estos resultados se realizaron los correspondientes diagramas de fase para mielina. De este análisis se pudo determinar que la fase no nativa de mielina puede sufrir una transformación isotérmica continua entre un espaciamiento expandido y uno compactado modificando solamente el entorno iónico de las membranas. Por el contrario, dicha transformación no puede ocurrir modificando solamente la temperatura. La conjunción de los resultados obtenidos mediante estudios de grosor en monocapas, espaciamiento en multicapas y composición dan fuertes indicios de que la fase no nativa de mielina es una fase enriquecida en lípidos que puede alterar su periodicidad de acuerdo a las condiciones iónicas del entorno, siendo más expandida o más compactada que la fase nativa. Mientras tanto, ésta última es quien retiene gran parte de las proteínas y mantiene su periodicidad prácticamente inalterable frente a cambios térmicos o liotrópicos. En síntesis, diferentes arreglos de MMPs, ya sea en multicapas, multicapas planas o monocapas tienden a ser consistentes en lo concerniente a sus diagramas de fases que abarcan condiciones desde fisiológicas hasta no fisiológicas, pero relevantes en diversas situaciones tales como la purificación de membranas y subfracciones de membranas. Estas diferentes condiciones operacionalmente utilizadas en el laboratorio ciertamente pueden llevar a la membrana a traspasar umbrales para sufrir reorganizaciones estructurales que deben ser tenidas en cuenta al manipular membranas.