Estudio de la metalo-beta-lactamasa anclada a membrana NDM-1 y análisis de su evolución clínica

Abstract

Los carbapenemes son potentes antibióticos β-lactámicos, reservados comodrogas de último recurso para el tratamiento de infecciones severas o por parte deorganismos resistentes. Desafortunadamente, la creciente prevalencia en las últimasdos décadas de organismos con resistencia a estas drogas, en particular de lasEnterobacterias Resistentes a Carbapenemes (CRE), constituye una seria amenaza a laefectividad del uso terapéutico de los mismos. El principal mecanismo de resistencia acarbapenemes es la producción de carbapenemasas, β-lactamasas capaces de degradarel antibiótico e inactivarlo. De acuerdo a su mecanismo catalítico se distinguen dos tipode estas enzimas: las serín-β-lactamasas que utilizan un residuo de serina en su sitioactivo para formar un intermediario covalente con el antibiótico y luego hidrolizarlo, ylas metalo-β-lactamasas (MBLs), que utilizan iones Zn(II) para posicionar el sustrato ygenerar el hidroxilo que actúa como nucleófilo, sin formación de un intermediariocovalente.NDM-1 es una de las MBLs de relevancia clínica de más reciente aparición. Desdesu identificación en el año 2008, se ha expandido con gran rapidez a nivel mundial, y yaha sido detectada en más de 70 países. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clasedebido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de lamembrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLscaracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe ala presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder deNDM-1, reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservadoen bacterias. Hasta el momento se han descripto 19 variantes naturales de NDM, lascuales difieren entre sí por un número reducido de mutaciones puntuales.La presencia de Zn(II) en el sitio activo de las MBLs es indispensable para sufuncionamiento. El espacio periplasmático, donde actúan estas enzimas en Gramnegativos,carece de mecanismos capaces de mantener la homeostasis de este metal,por lo que el Zn(II) disponible para las MBLs se encuentra directamente ligado a suconcentración extracelular. Esto adquiere importancia durante una infección, dado queel sistema inmune utiliza la respuesta de Inmunidad Nutricional para restringir ladisponibilidad de Zn(II) y otros cationes metálicos para el patógeno invasor. Comoparte de este mecanismo, los neutrófilos liberan en los sitios de infección grandesconcentraciones de calprotectina (CP), una proteína capaz de quelar con alta afinidadZn(II) y Mn(II). En el presente trabajo de tesis se estudió el efecto de la disponibilidad de Zn(II)sobre la capacidad de conferir resistencia de las MBLs. En particular, se evaluó el efectodel anclaje a membrana de NDM-1 sobre las propiedades de la enzima, haciendo focoen su tolerancia a baja disponibilidad de Zn(II). Además, se buscó evaluar quécaracterísticas de la enzima se encuentran bajo presión de selección mediante unanálisis comparativo de sus alelos clínicos.Para determinar el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la funcionalidad delas MBLs, se compararon las resistencias de células de E. coli productoras de las MBLsde mayor relevancia clínica (NDM-1, VIM-2, IMP-1 y SPM-1) en medio de crecimientosuplementado con distintas concentraciones del quelante ácido dipicolínico (DPA). Sibien la resistencia de todas las MBLs se vio reducida gradualmente por adición decantidades crecientes de DPA, se observó que distintas MBLs presentaban distintosgrados de susceptibilidad a la limitación de Zn(II). Se encontró además que la adiciónde quelantes al medio de crecimiento lleva a la degradación de las MBLs, debido a quelas formas desprovistas de metal de las mismas son más sensibles a la proteólisis.Se construyeron mutantes solubles de NDM-1 para analizar cómo afecta el anclajea membrana las propiedades de la enzima. Si bien estas variantes eran activas ybrindaban niveles de resistencia similares a los de NDM-1 salvaje en medio rico,resultaban más sensibles a la reducción en los niveles de Zn(II) extracelulares, y erandegradadas más rápidamente que la enzima salvaje cuando perdían metal. Por lo tantoel anclaje a membrana en NDM-1 contribuye a la adaptación de la enzima a bajadisponibilidad de Zn(II), incrementando su estabilidad frente a la proteólisis.La caracterización de los primeros 16 alelos clínicos de NDM-1 demostró que noexisten diferencias importantes entre los mismos en cuanto a la resistencia que otorganen medio de cultivo rico con elevada disponibilidad de Zn(II), en concordancia conreportes previos. Sin embargo, las propiedades de los alelos difieren marcadamentebajo limitación de Zn(II), y gran parte de ellos tienen mayor capacidad de conferirresistencia bajo estas condiciones respecto a NDM-1. Asimismo, muchos de los alelospresentan mayor estabilidad in vivo que NDM-1, observándose los mayoresincrementos en esta propiedad a causa de las mutaciones A233V y E152K. Por otrolado, la mutación más frecuente entre los alelos, M154L, contribuye a la adaptación dela enzima a condiciones de baja disponibilidad de Zn(II) mediante el incremento en laafinidad de unión de este metal.Se comprobó también que la localización de NDM-1 en la membrana externaincrementa su secreción a OMVs respecto a las formas solubles de la enzima. Las OMVs (vesículas de membrana externa) son partículas esféricas formadas a partir deprotrusiones de la membrana externa de Gram-negativos, que se escinden y liberan dela célula generando una vesícula cerrada rodeada de membrana externa y que contieneen su lumen componentes periplasmáticos. Las OMVs son producidas por todas lasbacterias Gram-negativas, bajo todas las condiciones de crecimiento, y se encuentranasociadas a una amplia variedad de procesos tales como adquisición de nutrientes,formación de biofilms, comunicación celular, resistencia a antibióticos y patogénesis.Se encontró que las OMVs que transportan NDM-1 poseen actividad β-lactamasa, y queson capaces de proteger a células sensibles a antibióticos β-lactámicos de la acción delos mismos. Además, la caracterización de OMVs generadas por distintos aislamientosclínicos productores de NDM-1 demostró que estas vesículas pueden contener laenzima así como el gen codificante para la misma. Las OMVs por lo tanto podríanhaber contribuido a la rápida diseminación de NDM-1 a nivel mundial.