Estandarización del método cuantitativo de azocaseína para determinar la actividad proteolítica en sobrenadantes fúngicos de Escovopsis y Trichoderma

Abstract

Los hongos micoparásitos son capaces de hidrolizar las paredes celulares de su hospedador mediante la secreción de enzimas hidrolíticas, como las proteasas. La metodología basada en el uso del sustrato azocaseína para cuantificar la actividad proteolítica es una de las más robustas y reproducibles. Sin embargo en la literatura se presentan múltiples modificaciones de acuerdo a su aplicabilidad y el tipo de microorganismo. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue establecer las condiciones de reacción óptimas, al emplear la enzima pura papaína para cuantificar la actividad proteolítica de sobrenadantes enzimáticos fúngicos de Trichoderma y Escovopsis. Se ensayó el efecto del tiempo, el pH y la temperatura de reacción sobre la actividad enzimática a distintas concentraciones de papaína. Para medir la actividad se utilizó el sustrato cromogénico azocaseína. Los sobrenadantes enzimáticos se obtuvieron mediante fermentación liquida de dos micoparásitos fúngicos: Escovopsis HEP25 y Trichoderma POS7. De acuerdo a los parámetros evaluados, se observaron actividades proteolíticas significativas a 50 min de reacción, 37 °C y pH 7,4. La actividad se expresó en términos de unidades equivalentes a la actividad de una masa determinada de papaína (1 unidad = 1 mg de papaína). Para la cepa Trichoderma POS7 se obtuvo una actividad de 54.3 ± 2.8 U/L, y para la cepa Escovopsis HEP25 de 2 ± 0.5 U/L. Se determinó que la metodología ajustada y el cálculo de actividad enzimática fueron apropiados para analizar las muestras de sobrenadantes crudos. Particularmente, para el género Escovopsis se reporta por primera vez la determinación de actividad proteolítica.

Mycoparasitic fungi are capable of hydrolyzing the cell walls of their host by secreting hydrolytic enzymes, such as proteases. To quantify proteolytic activity, the methodology based on the use of the azocasein substrate is considered one of the most reliable methodologies. However, in the literature it has multiple modifications available according to its applicability and the type of microorganism. Therefore, this work was aimed to establish the optimal reaction conditions using the papain pure enzyme; in order to quantify the proteolytic activity of fungal enzyme supernatants from Trichoderma and Escovopsis. The effect of reaction time, pH, and temperature over enzymatic activity at different concentrations of papain was tested. The chromogenic substrate azocasein was used to measure the enzymatic activity. Enzyme supernatants were obtained by liquid fermentation of two fungal mycoparasites: Escovopsis HEP25 and Trichoderma POS7. According to the evaluated conditions, sig nificant proteolytic activities were observed at 50 min of reaction, 37 °C and pH 7.4.The activity was expressed in terms of units equivalent to the activity of a given mass of papain (1 unit = 1 mg of papain). For the Trichoderma strain (POS7) an activity of 54.3 ± 2.8 U/L was obtained, and for the Escovopsis strain (HEP25) of 2 ± 0.5 U / L. The adjusted methodology and the enzyme activity calculation were determined to be appropriate for analyzing the crude supernatant samples. Particularly, for the Escovopsis genus, the determination of quantitative proteolytic activity is reported for the first time.