Expresión de toxinas Cry recombinantes de Bacillus wiedmannii biovar thuringiensis FCC41 mediante dos metodologías de clonado

Abstract

Los agentes entomopatógenos son herramientas novedosas y con gran potencial para ser utilizadas dentro de los sistemas de manejo integrado de insectos plaga y vectores. Uno de los agentes más utilizados es la bacteria Bacillus thuringiensis debido a que durante la esporulación forma inclusiones proteicas, principalmente formadas por proteínas Cry, que poseen acción tóxica específica contra especies de distintos órdenes de insectos, entre los que se encuentran algunas especies de mosquitos vectores de importancia en salud pública. El manejo de las poblaciones de estos dípteros se ha realizado durante años por medio de insecticidas químicos o mediante productos formulados a base de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis (Bti). Sin embargo, durante los últimos años se ha observado el desarrollo de resistencia por parte de algunas poblaciones de mosquitos, por lo que la búsqueda de nuevos agentes de control es fundamental. Bacillus wiedmannii biovar thuringiensis FCC41 es una cepa nativa con actividad mosquitocida contra las especies Aedes aegypti, Aedes (Ochlerotatus) albifasciatus, Culex pipiens, Culex quinquefasciatus, y Culex apicinus. FCC41 posee 6 proteínas Cry identificadas como Cry4-like1, Cry4-like2, Cry52-like1, Cry52-like2, Cry24Ca y Cry41-like. El objetivo de este trabajo fue analizar la expresión individual de cada una de estas toxinas, para ello los genes cry fueron amplificados mediante la técnica de PCR e incorporados en el vector de expresión específico pSTAB. Las construcciones fueron abordadas por dos metodologías de clonado diferente. Se utilizó un sistema tradicional mediante enzimas de restricción y para la proteína Cry4-like1, la cual no tiene sitios de restricción compatibles con el vector, se utilizó el método ?Advanced Quick Assembly? (AQUA). Es una técnica novedosa que no requiere el uso de kit, enzimas de restricción o preparación de reactivos, la misma aprovecha el procesamiento intrínseco {in vivo} de fragmentos de DNA lineales con regiones cortas de homología de 16 a 32 pb mediadas por Escherichia coli. Los plásmidos obtenidos fueron introducidos en la cepa acristalífera 4Q7 de B. thuringiensis por medio de la técnica de electroporación. Se obtuvieron cepas recombinantes portadoras de las secuencias de interés, las cuales mostraron perfiles de crecimiento y esporulación similares entre sí. La presencia de las proteínas expresadas se detectó por SDS-PAGE y mediante microscopia electrónica de barrido. Los dos métodos fueron eficaces para clonar y expresar genes cry en sistemas heterólogos y podrán ser usados para estudiar la acción mosquitocida de cada toxina de manera individual y sinérgicamente y emplearlas en el control de poblaciones de mosquitos de importancia sanitaria.