Desarrollo de un ensayo de transfección transitoria para la producción de partículas virales pseudotipadas SARS-CoV-2 para la evaluación de nuevas terapias para COVID-19

Abstract

La pandemia por coronavirus 2019 (COVID-19) ha movilizado a muchos países a desarrollar vacunas y nuevas terapias para combatir la infección por SARS-CoV-2 mediante la inducción o transferencia de anticuerpos contra el virus 2. En ese sentido, los anticuerpos neutralizantes generados tras la infección están dirigidos contra la glicoproteína Spike del virus 3. La misma se encuentra expuesta en la superficie del virus y media la infección de las células del huésped. Existen métodos bien caracterizados y de alto rendimiento (ELISA) que permiten evaluar la afinidad de los anticuerpos contra SARS-CoV-2. Sin embargo, cuantificar la actividad de estos anticuerpos neutralizantes resulta dificultoso. Los ensayos de neutralización viral representan el método estándar para evaluar la capacidad de los anticuerpos de inhibir la infección por SARS-CoV-2. En este caso, los ensayos con virus vivo presentan una gran limitación por tratarse de un agente BSL-3 (del inglés, Biosafety Level 3) y, por lo tanto, se requieren instalaciones de alta complejidad para su manipulación. Una alternativa para eludir estas limitaciones consiste en hacer uso del hecho de que Spike puede ser pseudotipada en partículas virales no replicativas más seguras 1. De esta manera, los ensayos de neutralización pueden ser realizados en laboratorios BSL-2 de menor complejidad. Es por eso que el objetivo del presente trabajo consistió en desarrollar y optimizar un ensayo de transfección transitoria en células HEK-293T para la producción de pseudopartículas virales que expresen la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 tendientes al diseño de un ensayo de neutralización para la evaluación de tratamientos para COVID-19. Para ello, células HEK-293T (ATCC CRL-3216) fueron transfectadas con 5 plásmidos (provistos por la Dra. Jesse D. Bloom, Universidad de Washington, USA): uno que codifica para Spike (p-Spike), un set de 3 que codifican para las proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje de las pseudopartículas virales (p-Tat; p-Gag-Pol y p-Rev), y uno que codifica para el reportero ZsGreen (p-Luc-ZsGreen). En una placa de 24 pocillos se sembraron 105 células por pocillo en medio D10 (DMEM suplementado con suero fetal bovino 10%, antibiótico-antimicótico y L-glutamina 2mM) e incubadas a 37ºC y 5% CO2. Luego de 24 h, las células fueron incubadas con diferentes relaciones de ADNp:PEI: 1:1,25; 1:2,5 y 1:5 (µg de ADN plasmídico (mezcla de los 5 plásmidos): µg de PolyAr87 (PEI)) durante 3 h. Luego, las células fueron incubadas durante de 24 a 48 h adicionales. En todos los ensayos se utilizaron células HEK-293T (sin transfectar) como controles basales. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Asesor de Ética y Seguridad (CAES) de la FCV-UNL bajo el número de protocolo 617/20 (Acta N°69). La eficiencia de transfección se evaluó mediante microscopía de epifluorescencia y citometría de flujo. En el primer caso se tomaron imágenes representativas de los pocillos en campo claro y en fluorescencia en el canal verde utilizando un microscopio Zeiss Axio Observer Fluorescent Microscope (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Para la citometría, las células fueron tripsinizadas y resuspendidas en fluido de enfoque para su adquisición en el citómetro Attune, NxT Acoustic Focusing Cytometer (A24860, Life Technology). La estrategia de selección de poblaciones consistió en evaluar los singletes (células únicas) en un gráfico dot-plot de tamaño (área vs altura) (R1). Luego, se seleccionó la población de interés en un gráfico dot-plot de tamaño vs complejidad (R2). Finalmente, en R2 se evaluó el porcentaje de expresión del reportero ZsGreen (R3) mediante un histograma en BL-1-A. En la figura 1 se muestran las imágenes de la microscopía de epifluorescencia. A las 24 h solo se observaron células transfectadas (positivas) en las relaciones 1:2,5 y 1:5. No obstante, a las 48 h se observaron células positivas en las 3 relaciones, siendo mayor su número a mayor relación de ADNp:PEI. En cuanto a los resultados de citometría de flujo, en la tabla (B) se muestra el porcentaje de células transfectadas (% BL-1). A las 24 h, en la relación 1:5 se observó el mayor porcentaje de células transfectadas. Sin embargo, a las 48 h se observa un aumento en el porcentaje de transfección en las relaciones 1:2,5 y 1:5; siendo ésta última la que mayor eficiencia de transfección mostró (38,177%). Estos resultados muestran que la condición óptima para la transfección de las células HEK-293T es 48 h con una relación ADNp:PEI 1:5. La optimización del ensayo de transfección resulta una etapa clave para el desarrollo de futuros ensayos de neutralización viral, ya que se requiere de un alto porcentaje de células transfectadas para obtener un título elevado de partículas virales pseudotipadas con la Spike del SARS-Cov-2. Dichos ensayos resultan de gran interés ya que nos permitirán la evaluación de sueros hiperinmunes o anticuerpos monoclonales terapéuticos, la eficacia de nuevas vacunas y sueros de convalecientes en laboratorios BSL-2, como nuevas terapias para el tratamiento de COVID-19.