Estudio y caracterización funcional de la interacción de la E3 ligasa CRL4Cdt2 con el complejo regulador de la cromatina G9a GLP

Abstract

La formación y progresión de tumores está regulada en última instancia por la abundancia y la actividad de factores proteicos oncogénicos o supresores tumorales. En línea con esto se ha demostrado que la proteólisis irregular de factores proteicos implicados en la regulación del ciclo celular, la transcripción génica y la apoptosis contribuye a la transformación oncogénica y a la carcinogénesis. En células eucariotas, la homeostasis proteica está finamente regulada por el Sistema Ubiquitina/Proteosoma (Ubiquitin Proteasome System, UPS), que consiste en una compleja red enzimática encargada de transferir moléculas de ubiquitina a un sustrato y de este modo promover su degradación a través del proteosoma o modular su ubicación espacio temporal en una vía celular determinada. Por lo tanto, el estudio a nivel molecular de la cascada de ubiquitinación, junto con el desarrollo de compuestos que modulan componentes específicos del UPS, podrían facilitar el desarrollo y mejoramiento de nuevos y mejores tratamientos de distintas patologías. En este sentido, las ligasas de ubiquitina (o E3s) son excelentes candidatas debido a que estas enzimas son los efectores finales de la cascada de ubiquitinación y dictan la especificidad de la maquinaria del UPS. La E3 ligasa CRL4Cdt2 desempeña un rol fundamental en la regulación de la replicación y reparación del ADN, en condiciones normales como así también en respuesta al daño al ADN. Diferentes evidencias indican que las alteraciones en los niveles de CRL4Cdt2 pueden contribuir a la aparición y progresión del cáncer. Todos los sustratos conocidos de CRL4Cdt2 tienen un dominio PIP (PCNA Interacting protein) que interactúa con PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) asociado a la cromatina, y es precisamente la unión de los sustratos a PCNA lo que asegura su degradación. Por este motivo, con el objeto de identificar nuevos sustratos de CRL4Cdt2 que permitan ahondar en el mecanismo molecular de acción de este complejo, se realizó una purificación por afinidad en tándem de Cdt2 sobre-expresado y posterior espectrometría de masa en tándem en la fracción cromatínica. A partir de estos resultados se escogieron distintos candidatos teniendo en cuenta la frecuencia de aparición de los mismos en las distintas purificaciones y se logró validar la interacción de Cdt2 sobre-expresado en la cromatina con G9a y GLP. Estas proteínas son metiltransferasas de histonas que catalizan la mono y la dimetilación de la Histona 3 en la Lisina 9, esta marca epigenética se encuentra relacionada con silenciamiento transcripcional y es indispensable para la constitución de la heterocromatina. Debido a que G9a tiene la capacidad de metilar también proteínas no histónicas realizamos un análisis de modificaciones postraduccionales de Cdt2 en una línea control y en líneas knockout que no expresan G9a y GLP (generadas por el sistema CRISPR/Cas9), donde no se encontraron péptidos de Cdt2 metilados diferencialmente en la línea control, aunque se requieren estudios adicionales y más detallados para obtener una respuesta más sólida y definitiva.Logramos identificar y validar la interacción de Cdt2 con otras dos proteínas que interactúan con el complejo G9a/GLP y median su interacción con el ADN. Utilizando ARN de interferencia de Cdt2 comprobamos que la vida media de las proteínas que forman parte de este complejo no se encuentra regulada por esta E3 ligasa, así como tampoco la localización subcelular. Debido a que el silenciamiento de Cdt2 ocasiona re-replicación e inestabilidad genómica, desarrollamos también una línea celular que no expresa Cdt2 endógeno y expresa una construcción Cdt2-Flag que es inducible con doxiciclina. Los experimentos de vida media en diferentes clones de esta línea celular confirmaron los resultados obtenidos con ARN de interferencia. Por último, es importante destacar que CRL4Cdt2 también cumple un rol importante en la regulación de la respuesta celular a estrés genotóxico. Asimismo, recientemente se ha reportado que G9a interviene en la regulación de la respuesta al daño al ADN. Por lo tanto, estamos actualmente estudiando si la interacción funcional entre CRL4Cdt2 y G9a/GLP posee una función importante en la modulación de la respuesta celular a distintos daños. En este sentido hemos obtenidos resultados preliminares muy alentadores. Esperamos que en estudios posteriores podamos ahondar en la caracterización molecular del eje CRL4Cdt2/G9a y la función que cumple en el control de la integridad genómica.SISTEMA UBIQUITINA PROTEOSOMA, E3 LIGASAS, CRL4CDT2, UBIQUITINA, G9A/GLP.