Selección espermatica de semen refrigerado de llama con diluyente a base de yema de huevo

Abstract

The objective of the study was to separate motile and with functional membrane integrity sperm from diluents in cooled llama semen. A total of 21 ejaculates from 7 llama males were obtained and cooled with the follow methodology. Each sample was incubated with collagenase 0.1% and then divided in two aliquots: R- diluted 1:2 with a lactose-egg yolk diluent (L-E) and Rc- centrifugated at 800 g and the pellet resuspended in L-E diluent. Both samples where them cooled at 5 °C during 24 h. Three different methodologies were used to separate sperm from diluents; Androcoll-E-Large, Percoll® (45%, 45%-70%, 45%-80%, 45%-90% y 60%-90%) and swim up. Motile llama sperm with lower amount of egg yolk was obtain only when using Percoll® 45%, 45%-70%, 45%-80%. After this the remaining samples (14 ejaculates) where processed with the following methods. Raw semen was cooled with seminal plasma (R) and without it (Rc), with the following final treatments; Percoll® 45/70 (R70), 45/80 (R80) and Percoll® 45/70 (Rc70) y 45/80 (Rc80). When sperm variables showed statistical normality results were analyzed with a factorial design, if not a Friedman test was used. The Percoll® Rc80 was the one that separated higher motile and alive sperm free from the diluent compared with the other treatments evaluated. To conclude, this protocol can be used to process cooled llama sperm to apply in assisted reproduction biotechnologies.

El objetivo de este trabajo fue obtener espermatozoides móviles, libres de diluyente y con integridad funcional de la membrana plasmática a partir de eyaculados refrigerados de llama. Se refrigeraron un total de 21 eyaculados de 7 machos mediante la siguiente metodología: cada muestra se incubó en una solución de colagenasa al 0,1 % y se dividió dos alícuotas: R: se la diluyó 1:2 con un diluyente en base a lactosa-yema de huevo (L-Y) y Rc: se centrifugó a 800g y el pellet obtenido se resuspendió en 2 ml de L-Y. Ambas muestras se refrigeraron durante 24 hs a 5° C. En 7 eyaculados se probaron las siguientes metodologías: Androcoll-E-Large, Percoll® (45%, 45%-70%, 45%-80%, 45%-90% y 60%-90%) y swim up. Solamente los gradientes de Percoll® 45%-70% y 45%-80% permitieron obtener una fracción de espermatozoides móviles con una menor cantidad de yema, consecuentemente en los restantes 14 eyaculados se realizó el siguiente experimento: refrigerado con plasma seminal (R): Percoll® 45/70 (R70) y 45/80 (R80) y refrigerado sin PS (Rc): Percoll® 45/70 (Rc70) y 45/80 (Rc80). En las variables espermáticas en las que se logró normalidad se utilizó un diseño factorial y en el resto se utilizó el test de Friedman. El gradiente de Percoll® 45/80 realizado en muestras de espermatozoides refrigerados sin plasma seminal (Rc80) fue el que permitió obtener una muestra con un número suficiente de espermatozoides refrigerados móviles, libre de diluyente y con mayor porcentaje de espermatozoides vivos respecto al resto de los gradientes. Por lo tanto, es posible utilizar esta metodología en la preparación de espermatozoides refrigerados de llama para utilizar en protocolos de fertilización asistida.