Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina

Abstract

La tuberculosis (TB), enfermedad causada por el patógeno Micobacterium tuberculosis (Mtb), continúa siendo un importante problema para la salud pública a pesar de la existencia de programas nacionales e internacionales de control de la enfermedad. Ha sido demostrado que los factores genéticos contribuyen al desarrollo de la TB, con una heredabilidad (proporción de la variación fenotípica en una población atribuible a componentes genéticos) estimada que oscila entre el 36% y el 70%. Identificarel rol de los factores genéticos en la resistencia/susceptibilidad a la tuberculosis podría contribuir al desarrollo de medidas preventivas y terapias genotípicasespecíficas, optimizando la respuesta inmune frente a Mtb. El enfoque más ampliamente empleado para investigar la susceptibilidad genética a la TB es mediante estudios de asociación de genes candidatos. Los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) son la “marca genética de susceptibilidad” elegida en estudios de caso-control. Teniendo en cuenta la importancia de las citoquinas IL-17A, IL-17F e IFN- en la respuesta inmune frente a Mtb, en el presente trabajo de tesis se estudió la asociación de los SNPs rs2275913 (GA) del gen de la IL-17A, rs763780 (TC) del gen de la IL-17F y rs1861494 (GA) del gen del IFN- con la susceptibilidad de la TB y con la severidad de la enfermedad. La genotipificación de las poblaciones de pacientes con TB y de individuos sanos (DS) se realizó mediante la técnica de PCR alelo específica (ARMS-PCR). Se evaluó además el impacto que dichos polimorfismos podrían tener en la respuesta inmune del hospedador. Para esto, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de individuos portadores de las distintas variantes de los SNP fueron estimuladas con un lisado de Mtb, y diferentes parámetros inmunológicos fueron medidos. También se estudió la asociación de los SNPs con parámetros clínicos de severidad de la TB. Se demostró que el alelo A y el genotipo GA y AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A se encuentran sub-presentados en la población de pacientes con TB, indicando que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. Más aún, estimulando CMSP de DS con un lisado de Mtb, se detectaron la mayor producción de IL-17A e IFN- en sobrenadantes de cultivo, los porcentajes más altos de células T CD4+ productoras de estas citoquinas, la mayor expresión de SLAM y el índice de proliferación más alto en los individuos portadores del genotipo AA, en comparación con los individuos portadores del genotipo GG. Estos resultados indican que losDS portadores del genotipo AA montarían una respuesta inmune más efectiva frente a un primer contacto con la bacteria. Dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo A y el genotipo AA estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes bajos respondedores (BR), individuos con una respuesta inmune pobre contra Mtb. A su vez, se observó que las CMSP estimuladas de estos pacientes presentaban los mayores niveles de IL-17A y los menores de IFN- secretados en sobrenadantes de cultivos, el mayor porcentaje de células T CD4+ productoras de IL-17A, la menor expresión de SLAM en sus linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en comparación con los pacientes portadores del genotipo GG, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. De hecho, se encontró una asociación entre los pacientes portadores del genotipo AA yparámetros clínicos de mayor severidad de la TB (mayor número de bacilos en esputo y las lesiones radiológicas de pulmón más severas). Así, sepropone al genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A como un marcador de resistencia a la TB y de mayor severidad de la enfermedad en Argentina. A continuación, se estudó la relación entreel SNP rs763780 del gen de la IL-17F y la TB.Se encontró al alelo C y a los individuos portadores de este alelo (TC/CC) sobre-representados en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de susceptibilidad a la TB. En concordancia con estos resultados, se observó que las CMSP estimuladas de DS portadores del alelo C presentaban el menor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFN-, la menor expresión de SLAM por parte de linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en respuesta al lisado de Mtb, indicado que estos individuos montarían una respuesta inmune más pobre frente a un primer contacto con la bacteria. Interesantemente, se observó una mayor secreción de IL-17F por parte de CMSP estimuladas de DS en comparación con pacientes con TB, sin encontrarse diferencias entre los individuos portadores de las distintas variantes del SNP. Más aún, se detectaron los menores niveles de IL-17F en pacientes BR, sugiriendo que esta citoquina cumpliría un rol en la respuesta inmune generada contra Mtb. Además, dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo C y los individuos portadores de este alelo estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes BR. También, se detectaron los menores niveles de IFN- y los mayores de IL-17A en sobrenadantes de cultivo, el mayor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IL-17A y el menor índice de proliferación en las CMSP estimuladas de pacientes portadores del alelo C en comparación con los pacientes TT, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. Asimismo, se evidenció que la mayoría de los pacientes portadores del alelo C presentaban un mayor número de bacilos en esputo al contrastarlos con los pacientes TT. Por esto, se propone alalelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17Fcomo un marcador de susceptibilidad y de mayor severidad de la TB en Argentina. Por último, el estudio caso-control paraanalizar la asociación entre el SNP rs1861494 del gen delIFN- y la TB reveló que el alelo A y el genotipo AA se encuentra sub-representado en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. De hecho, se encontró que las CMSP estimuladas con un lisado de Mtb de RESÚMEN 5 DS portadores del genotipo AA secretaban los mayores niveles de IFN- y tenían los porcentajes más altos de linfocitos T CD4+ productores de esta citoquina, en comparación con los individuos GG, citoquina crucial en la respuesta inmune del hospedador contra la bacteria. Sin embargo, dentro de la población de pacientes con TB no se observaron diferencias en ninguno de los parámetros inmunológicos medidos entre pacientes portadores de las distintas variantes del SNP. Tampoco se evidenció asociación entre el SNP y parámetros clínicos de severidad de la enfermedad. Así, sepropone alalelo A y al genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN-como marcadores de resistencia a la TB, sin relación con la severidad de la enfermedad en Argentina. En conclusión, la identificación del genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A y del genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN- como marcadores de resistencia a la TB; del alelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17F como un marcador de susceptibilidad a la TB; y el rol demostrado de estas citoquinas en la inmunología de la enfermedad podrían contribuir al diseño de vacunas más efectivas y a identificar sub-poblaciones de riesgo a contraer la enfermedad en Argentina. Además, la asociación del genotipo AA del SNP rs2275913 y del alelo C del SNP rs763780 con una mayor severidad de la TB en los pacientes de Argentina podría utilizarse en la implementación de nuevas estrategias de tratamiento paciente-específica.

Tuberculosis (TB), a disease caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continues to be a major public health problem despite the existence of national and international disease control programs. It has been demonstrated that genetic factors contribute to the development of TB, with an estimated heritability (the proportion of variation in a phenotypic trait in a population that is due to genetic variation between individuals) ranging from 36% to 70%. Identifying the role of genetic factors in resistance/susceptibility to tuberculosis mightcontribute to the development of preventive strategies and genotypic-specific therapies that improve the immune response against Mtb. The most widely approach used to investigate the genetic susceptibility to TB is by candidate gene association studies. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the "genetic susceptibility mark" chosen in case-control studies. Taking into account the importance of the IL- 17A, IL-17F and IFN- cytokines in the immune response against Mtb, in the present investigation we studied the association of theIL-17A rs2275913 (GA)SNPs, the IL-17F rs763780 (TC) SNP and the IFN- rs1861494 (GA) SNP with the susceptibility to TB and the severity of the disease. Genotyping of TB patients and healthy individuals (HD) populations was performed using the Amplification-refractory mutation system PCR (ARMS-PCR) technique. In addition, the impact of these polymorphisms on the host immune response was evaluated. To do this, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from individuals bearing the different SNP variants were stimulated ABSTRACT 6 with a Mtb lysate and different immunological parameters were studies. Besides, the association of the SNPs with clinical parameters related TB severitywas also analyzed. The A allele and the GA and AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP were shown to be at lower proportion in the TB patient population, indicating that this SNP could be considered as a marker of TB resistance. Furthermore, as compared to HD carrying the GG genotype, AA individuals displayed the highest production of IL-17A and IFN- in culture supernatants, the highest percentages of CD4+ T cells producing these cytokines, the highest SLAM expression and the highest proliferation indexby Mtb-stimulated PBMCs. These findings indicate thatAA HD would mount a more effective immune response againstMtb at a first contact. Within the TB patient population, the A allele and the AA genotype were identified in a higher proportion in the sub- population of low responder (LR) patients, individuals with a poor immune response against Mtb. In fact, Mtb-stimulated PBMCs of these patients displayed the highest levels of IL-17A and the lowest of IFN- in culture supernatants, the highest percentage of IL-17A-producing CD4+ T cells, the lowest expression of SLAM in their CD3+ T lymphocytes and the lower proliferation index, immunological parameters associated with greater severity of TB, compared to patients carrying the GG genotype.Moreover, an association between patients with AA genotype and clinical parameters of higher TB severity(greater number of sputum bacilli and more severe radiological lesions) was detected. Thus, the IL-17A rs2275913 AA genotype is proposed as a marker of TB resistance, but also related tohigher disease severity in Argentina. Then,the association between the IL-17F rs763780 SNP and TB was studied. The C allele and individuals carrying this allele (TC/CC) were found in a higher proportion in the TB patient population, suggesting that this SNP could be considered as a marker of TB susceptibility. In agreement with these results, it was observed that Mtb-stimulated PBMCs carrying the C allele ABSTRACT 7 displayed the lowest percentage of CD4+ T cells producing IFN-, the lowest SLAM expression in CD3+ T lymphocytes and the lowest proliferation index in response to Mtb lysate, indicating that HD carrying the C allele would mount a poorer immune response against a first contact with the bacterium. Interestingly, Mtb-stimulated PBMCs from HDshowed increased secretion of IL-17F in comparison with TB patients, with no differences detected among individuals carrying the different SNP variants. Moreover, lower levels of IL-17F were detected in LR patients, suggesting that this cytokine would play a role in the immune response generated against Mtb. In addition, within the TB patient population, the C allele and individuals carrying this allele were found in a higher proportionat the sub-population of LR patients. Furthermore, lower levels of IFN- and higher levels of IL-17A were detected in culture supernatants ofMtb-stimulated PBMCsfromTB patients carrying the C allele, with the highest percentage of IL-17A producing CD4+T cells and the lowest proliferation index. Besides, it was evidenced that the majority of the TB patients carrying the C allele had a greater number of sputum bacilli as compared to TT patients. Therefore, the C allele of the IL-17F rs763780 SNP is proposed as a marker of TB susceptibility and related to higher disease severity in Argentina. Finally, the case-control study analyzing the association between the IFN-rs1861494 SNP and TB revealed that the A allele and AA genotype wasin a lower proportion in the TB patients population, suggesting that this SNP could be considered as a marker of TB resistance. In fact, Mtb-stimulated PBMCs fromHD carrying the AA genotype displayed the highest levels of IFN- and the highest percentages of CD4+ T cells producing this cytokine, whichis crucial in the host's immune response against the bacterium. However, within the TB population, no differences were observed in any of the immunological parameters measured among patients carrying different SNPs variants. Besides, there was no association between the SNP and clinical parameters of the ABSTRACT 8 disease severity. Thus, the A allele and the AA genotype of the IFN- rs1861494 SNP are proposed as TB resistance markers, with no association with the severity of the disease in Argentina. In conclusion, the identification of the AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP and the AA genotype of the IFN-rs1861494 SNP as TB resistance markers; the C allele of the IL-17F rs763780 SNP as a marker of TB susceptibility; and the demonstrated role of these cytokines in the immunology of the disease could contribute to the design of more effective vaccines and to identify sub-populations at risk of developing the disease in Argentina. In addition, the association of the AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP and the C allele of the IL-17F rs763780 SNP with a higher TB severity in Argentine patients could be useful in the implementation of new patient- specific treatment strategies