Efecto beneficioso de GLP-2 sobre la expresión y actividad de transportadores ABC intestinales en la endotoxemia experiemental

Abstract

La función de los transportadores ABC se ve afectada en varias enfermedades intestinales en los seres humanos, en particular las que cursan con inflamación local o sistémica. En el modelo de inflamación inducido por la administración de LPS a ratas (5 mg/kg de peso corporal por vía i.p.), confirmamos que a las 24 h se produce una disminución en la expresión y actividad de los transportadores Mrp2 y P-gp intestinales. Observamos que LPS, por un lado, disminuyó los niveles de ARNm de ambos transportadores y por otro, produjo la internalización de los transportadores en vesículas endocíticas. Estas observaciones señalan que los cambios a nivel proteico de los transportadores resultan complejos y dependen de una regulación a nivel transcripcional y postranscripcional. Determinamos también que IL-1β media la regulación postraduccional observada para Mrp2. Sin embargo, IL-1β no media la regulación de P-gp, ni la regulación a nivel transcripcional de Mrp2. Recientemente, a GLP-2 le fue asignado un papel clínico como potencial agente terapéutico debido a su capacidad para proteger al intestino en varios modelos de daño intestinal. Nos propusimos entonces estudiar la capacidad de GLP-2 de contrarrestar los efectos del LPS sobre ambos transportadores. Utilizamos dos tipos de protocolos de tratamiento con GLP-2. Uno que evalúe la capacidad preventiva de la hormona, administrándola antes de la inducción de la endotoxemia (7 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. separadas cada 12 h en un total de 72 h consecutivas). Y otro que evalúe la capacidad de GLP-2 de revertir los efectos inducidos por LPS una vez instalados (2 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. comenzando 3 h después de la inyección con LPS). Los resultados muestran que las alteraciones en la expresión y actividad de los transportadores producidas por LPS pudieron ser prevenidos mediante el tratamiento con GLP-2, siendo estos cambios al menos en parte dependientes de una regulación transcripcional. GLP-2 per se indujo los niveles de Mrp2 intestinal tanto a nivel de proteína como de ARNm, mientras que no ocurrió lo mismo para P-gp. En cambio, el tratamiento de reversión con GLP-2 fue ineficiente en recuperar los niveles de Mrp2 y P-gp (proteína y ARNm). En el caso particular de Mrp2, GLP-2 administrado sólo tampoco pudo producir cambios en la expresión de proteínas o ARNm, en contraste con la inducción observada para el protocolo de prevención. Claramente, más de dos dosis de GLP-2 son necesarias para modular la expresión de Mrp2. La observación de que GLP-2 induce Mrp2 a nivel de ARNm sugiere la posibilidad de una regulación transcripcional. GLP-2 actuaría presuntamente mediante su receptor asociado a proteína G, el cual activa adenilato ciclasa. Confirmamos la mediación de AMPc in vivo y en células Caco-2. Estudiamos la posible vía de señalización por la cual GLP-2 induce transcripcionalmente a MRP2 en células Caco-2 tratadas con db-AMPc, un análogo permeable del AMPc. Observamos que db-AMPc activó PKA, que luego fue capaz de activar de forma directa o indirecta por forforilación a ATF-2 y c-JUN. Luego estos factores formaron heterodímeros y se unieron a la región regulatoria proximal (−789/−603) del promotor de MRP2 que contiene sitios putativos AP-1 y CRE. De esta manera db-AMPc aumentaría la transcripción de MRP2 resultando en un aumento de la expresión del transportador en la membrana apical y en un aumento de su actividad. En conclusión, la modulación de estos importantes transportadores de eflujo apicales puede representar un efecto beneficioso adicional de GLP-2 bajo condiciones de inflamación, que contribuyen a restaurar la barrera transcelular, limitando así la absorción de compuestos potencialmente tóxicos.

ABC transporters function is affected in various intestinal diseases in humans, particularly those with local or systemic inflammation. We confirm that at 24 h there is a decrease in the expression and activity of intestinal P-gp and Mrp2 transporters in the inflammatory model induced by administration of LPS to rats (5 mg/kg of body weight by i.p. injection). We observed that LPS decreased the mRNA levels of both transporters and also produced internalization of Mrp2 and P-gp to endocytic vesicles. These observations indicate that changes at transporters protein levels are complex and depend on transcriptional and post-transcriptional regulation. We also determined that IL-1β is involved in the post-translational regulation observed for Mrp2. However, IL1β neither regulates P-gp nor is involved in the transcriptional regulation of Mrp2. Recent reports gave GLP-2 a clinical role as a potential therapeutic agent due to its ability to protect the bowel in various models of intestinal injury. However, no report evaluates the role of GLP-2 in the regulation of the transcellular barrier associated with drug transporters. We then decided to study the ability of GLP-2 to neutralize the effects of LPS on both transporters. Two types of GLP-2 protocols were used. One evaluates the preventive capacity of GLP-2, starting its administration before the induction of endotoxemia (7 s.c. injections of 125 μg/kg b.w. separated every 12 h for a total of 72 consecutive hours). The second protocol evaluates the capacity of GLP-2 to revert the effects of LPS once inflammation is installed (2 s.c. injections of 125 μg/kg b.w. beginning 3 h after LPS injection). The results show that the altered expression and activity of the transporters produced by LPS could be prevented by GLP-2 treatment, due, at least in part, to transcriptional regulation. GLP-2 alone induced intestinal Mrp2 both at protein and mRNA levels, while it did not affect P-gp expression. In contrast, the reversion protocol with GLP-2 was ineffective in recovering Mrp2 and P-gp levels (protein and mRNA). GLP-2 administered alone did not change the expression of Mrp2 protein or mRNA, in contrast to the induction observed for the prevention protocol. Clearly, more than two doses of GLP-2 are necessary to modulate Mrp2 expression. The fact that GLP-2 induces Mrp2 mRNA suggests the possibility of a transcriptional regulation. GLP-2 would presumably act through its receptor associated to G protein, which activates adenylil cyclase. We confirm the involvement of cAMP in vivo and in Caco-2 cells. We studied the possible signaling pathway of GLP-2 that leads to transcriptional induction of MRP2 by treating Caco-2 cells with db-cAMP, a cAMP permeable analog. As a result, db-cAMP activated PKA, which was then able to activate ATF-2 and c-JUN directly or indirectly by phosphorylation. Then these nuclear factors formed heterodimers and bound the proximal regulatory region (−789/−603) of MRP2 promoter which contains putative sites AP-1 and CRE. This way db-cAMP would increase the transcription of MRP2, resulting in increased expression of the transporter in the apical membrane and increased activity. In conclusion, positive modulation of these important apical efflux transporters may represent an additional beneficial effect of GLP-2 under conditions of inflammation, contributing to restoring the transcellular barrier, thereby limiting the absorption of potentially toxic compounds.