Development of typing methods based on pyrosequencing technology fot the analysis of six bovine genes related to marbling

Abstract

Several methods such as PCR-RFLP, OLA, DNA sequencing, PCR-SSCP and ARMS-PCR have been developed to detect the allelic variation at substitutions K232A of DGAT1, GH6.1 of GH, F279Y of GHR, R4C of LEP, I74V of FABP4, and at the transition in the TG 5´ leader sequence. Most of these methods are manual processes and therefore increase the time spent on the assay and limit the number of animals analyzed. Herein, we describe the development of pyrosequencing-based methods for the bovine DGAT1, GH, GHR, LEP, FABP4 and TG genes, whose polymorphisms have been associated with variation in carcass composition. This method was validated by analyzing DNA samples belonging to the Aberdeen Angus and Hereford breeds previously typed by PCR-SSCP, PCR-RFLP and/or DNA sequencing. The results obtained showed that, after sequencing or whole-genome association studies (discovery step), the pyrosequencing-based technique seems to be useful to validate (validation step) a particular single nucleotide polymorphism (SNP) in a candidate gene in a previously mapped region in independent populations (with different genotypes and/or production systems). We conclude that pyrosequencing may be useful in high-throughput SNP genotyping of candidate genes in breeds of cattle and other animal species, making it a fast and interesting screening method for population or association studies.

Diversos métodos como PCR-RFLP, OLA, secuenciación de ADN, PCR-SSCP y ARMS-PCR han sido desarrollados para detectar las variaciones alélicas presentes en las sustituciones K232A del gen DGAT1, GH6.1 del gen GH, F279Y de GHR, R4C de LEP, I74V de FABP4, y en la transición detectada en la secuencia 5´ líder del gen TG. La mayoría de estos métodos son procesos manuales que consumen mucho tiempo para realizar el ensayo y limitan el número de animales analizados. En el presente trabajo se describe el desarrollo de métodos de pirosecuenciación aplicables a los genes bovinos DGAT1, GH, GHR, LEP, FABP4 y TG, cuyos polimorfismos han sido asociados a variaciones en la composición de la carcasa. Este método se validó mediante el análisis de muestras de ADN pertenecientes a las razas Aberdeen Angus y Hereford previamente tipificadas por PCR-SSCP, PCR-RFLP y/o secuenciación de ADN. Los resultados obtenidos evidenciaron que, después de estudios de secuenciación o asociación genómica (etapa de descubrimiento), la pirosecuenciación sería de gran utilidad para validar (etapa de validación) un polimorfismo de nucleótido único (SNP) particular en un gen candidato localizado en una región previamente mapeada en poblaciones independientes (con diferentes genotipos y/o sistemas de producción). Concluimos que los métodos basados en pirosecuenciación pueden ser de gran utilidad en la genotipificación de alto rendimiento de SNPs de genes candidatos en razas bovinas y en otras especies animales, representando un rápido e interesante método de validación para estudios poblacionales o de asociación.