Síntesis de filtros UV (micosporinas) en Phaffia rhodozyma. Caracterización de los genes y enzimas responsables

Abstract

La exposición a la radiación ultravioleta (RUV) es perjudicial no solo para los organismos vivos, sino también en los niveles más complejos de organización, como las comunidades y los ecosistemas. Muchos productos químicos orgánicos utilizados en la protección solar comercial poseen actividad estrogénica in vivo. Además, suelen ser altamente lipofílicos y, por consiguiente, pueden ser bioacumulados en el ambiente y en los lípidos de los organismos. En este escenario, se hace evidente la necesidad de buscar alternativas naturales y ambientalmente inocuas, surgiendo las micosporinas y los aminoácidos tipo micosporinas como alternativas naturales muy prometedoras tanto para la protección directa (absorción de UV) como indirecta (antioxidante).En la presente tesis doctoral se estudió la producción de compuestos fotoprotectores en Phaffia rhodozyma y su relación con la diversidad genética y factores ecológicos y geográficos. Se individualizaron y caracterizaron los genes intervinientes y se propone una vía metabólica responsable de la síntesis de micosporina-glutaminol-glucósido (MGG), además de establecer su rol biológico. Este conocimiento generado permite sentar las bases genéticas que permitan la aplicación industrial de estos compuestos de importancia biotecnológica.Se analizaron los casos actuales de aplicación (patentes) de las micosporinas y aminoácidos tipo micosporinas, evidenciando que la búsqueda de moléculas fotoprotectoras naturales es relativamente reciente. Hasta la fecha, la búsqueda se ha centrado en organismos procedentes de ambientes marinos con un claro predominio de algas como fuente de compuestos fotoprotectores y por consiguiente, los ambientes terrestres y las propiedades de las micosporinas han sido poco exploradas. En este contexto, hemos desarrollado un método molecular (PCR multiplex) que nos permitió identificar un gran número de aislamientos ambientales de P. rhodozyma y excluir a las especies relacionadas con las cuales co-habita, con el fin de evaluar su producción de micosporinas y analizar factores genéticos, ecológicos y geográficos.Presentamos un clúster génico como el potencial responsable de la síntesis de MGG y proporcionamos evidencia de ello mediante la creación y utilización de mutantes de deleción de cada uno de dichos genes (mutantes knockout). Así mismo, el análisis cromatográfico (HPLC) de los compuestos producidos por estas cepas mutantes nos permitió esclarecer el origen del metabolito precursor de esta vía, pudiendo provenir tanto de la vía del ácido shikímico (3-deoxi-D-arabinoheptulosinato fosfato) como de la vía de las pentosas fosfato (sedoheptulosa 7-fosfato), a través de una convergencia en la enzima O-metiltransferasa (Omt).El estudio de las regiones regulatorias del clúster génico por métodos bioinformáticos nos permitió encontrar una posible co-regulación a nivel transcripcional debido a la presencia de un promotor bidireccional entre los genes ddgs y omt. Se encontraron motivos de unión a factores de transcripción en la región reguladora del gen omt que podrían explicar la evidencia experimental sobre la estimulación en la síntesis de MGG debido a la luz (Light Responsive Elements) y por estrés oxidativo (cAMP Responsive Elements). En este sentido, pudimos determinar mediante RT-qPCR que los niveles de expresión génica efectivamente aumentaban cuando los organismos eran expuestos a la RUV. Adicionalmente, pudimos confirmar de manera experimental la función de pantalla solar in vivo de las micosporinas en levaduras, dado que la tasa de supervivencia UV fue significativamente mayor en las cepas de P. rhodozyma que produjeron MGG que en aquellas que no lo hicieron.El valor de desentrañar las bases moleculares de la síntesis de micosporinas en organismos eucariotas no sólo es de fundamental importancia debido a la interesante historia evolutiva de este metabolito y su destacado papel ecológico en la naturaleza, sino también para desarrollar estrategias de producción de un protector UV-B natural con el potencial de reemplazar a las contrapartes sintéticas utilizadas actualmente.

Exposure to ultraviolet radiation (UVR) is harmful not only to living organisms, but also at more complex levels of organization, such as communities and ecosystems. Many organic chemicals used in commercial sunscreen products have estrogenic activity in vivo. In addition, they are often highly lipophilic and can therefore be bioaccumulated in the environment and in the lipids of organisms. In this scenario, the need to look for natural and environmentally innocuous alternatives becomes evident, with the emergence of mycosporines and mycosporine-like amino acids as very promising natural alternatives for both direct (UV absorption) and indirect (antioxidant) protection. The present thesis studied the production of photoprotective compounds in Phaffia rhodozyma and their relationship with genetic diversity and ecological and geographical factors. The genes involved were individualized and characterized, and a metabolic pathway responsible for the synthesis of mycosporine-glutaminol-glucoside (MGG) was proposed, in addition to establishing its biological role. This knowledge allowsto establish the genetic bases that it will make the industrial application of these compounds of biotechnological importance possible. Current applications (patents) of mycoporines and mycosporin-like amino acids were analyzed, revealing that the search for natural photoprotective molecules is relatively recent. To date, research has focused on organisms from marine environments with a clear predominance of algae as a source of photoprotective compounds and therefore, terrestrial environments and the properties of mycoporines have been poorly explored. In this context, we have developed a molecular method (multiplex PCR) that allowed us to identify a large number of environmental isolations of P. rhodozyma and exclude the species related to which it co-habits, in order to evaluate its production of mycosporines and analyze genetic, ecological and geographical factors. We present a gene cluster as the potential responsible for the synthesis of MGG and provide evidence of this by the creation and use of deletion mutants of each of these genes (knockout mutants). Likewise, the chromatographic analysis (HPLC) of the compounds produced by these mutant strains allowed us to clarify the origin of the precursor metabolite of this pathway, being able to come both from the shikimate pathway (3-deoxi-D-arabinoheptulosinate phosphate) and from the phosphate pentose pathway (sedoheptulose 7-phosphate), through a convergence in the Omethyltransferase (Omt) enzyme. The study of the regulatory regions of the gene cluster by bioinformatics methods allowed us to find a possible co-regulation at transcriptional level due to the presence of a bidirectional promoter between ddgs and omt genes. We found transcription factors binding motifs in the omt gene regulatory region that could explain experimental evidence on stimulation in MGG synthesis due to light (Light Responsive Elements) and oxidative stress (cAMP Responsive Elements). In this sense, we were able to determine by RT-qPCR that gene expression levels actually increased when organisms were exposed to UVR. In addition, we were able to experimentally confirm the in vivo sunscreen function of mycosporines in yeast, since UV survival rate was significantly higher in P. rhodozyma strains that produced MGG than in those that did not. The value of unraveling the molecular bases of mycosporine synthesis in eukaryotic organisms is not only of fundamental importance due to the interesting evolutionary history of this metabolite and its outstanding ecological role in nature, but also to develop strategies for the production of a natural UV-B protector with the potential to replace the synthetic counterparts currently used.