Zonda, un nuevo regulador de la respuesta autofágica en Drosophila melanogaster

Abstract

La autofagia es un proceso evolutivamente conservado por el que las células eucariotas llevan a cabo la auto-digestión de componentes citoplasmáticos. Este es un mecanismo de adaptación a distintas condiciones de estrés, tales como el ayuno y las infecciones por patógenos intracelulares. En células de mamífero en cultivo, plantas y gusanos se ha visto previamente que la autofagia también puede desencadenarse en respuesta a hipoxia, desempeñando un papel adaptativo esencial en esta condición. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral estudiamos la autofagia inducida por ayuno o hipoxia, utilizando a Drosophila melanogaster como organismo modelo. La vía autofágica disparada por ayuno se encuentra ampliamente estudiada en este organismo, el cual además puede sobrevivir durante varios días en niveles de oxígeno extremadamente bajos.En el presente trabajo hemos identificado una nueva inmunofilina de Drosophila, que denominamos Zonda, esencial para la autofagia inducida por ayuno. Encontramos que Zonda se requiere en etapas tempranas de la cascada, puntualmente para la deposición de fosfatidilinositol-3-fosfato en estructuras membranosas asociadas al retículo endoplasmático conocidas como omegasomas, proceso mediado por el complejo Vps34 específico de la autofagia. En condiciones basales, Zonda presenta una distribución citoplasmática y luego del ayuno se dispone en foci asociados al retículo endoplasmático, que co-localizan con marcadores de omegasoma. Encontramos también que la nucleación de Zonda depende del complejo de iniciación (Atg1, Atg13 y Atg17), pero no del complejo de nucleación (Vps34, Vps15, Atg6 o Atg14). Asimismo, observamos que Zonda interactúa físicamente con el dominio quinasa de Atg1, así como también con Atg6 y Vps34. Proponemos entonces que Zonda es un nuevo componente de la cascada autofágica requerido para la biogénesis del omegasoma.Paralelamente durante este proyecto de Tesis caracterizamos la respuesta autofágica inducida por hipoxia en D. melanogaster, proceso que hasta el momento no se había analizado en este organismo. Encontramos que este mecanismo se desencadena en células del cuerpo graso de larvas sometidas a 4% O2. La inducción de esta respuesta se estudió a distintos tiempos de exposición hipóxica, mediante el uso de diferentes reporteros de autofagia. A las 2 horas de hipoxia observamos la formación de estructuras autofágicas incipientes, indicando el inicio del proceso. Luego de 6 horas de hipoxia, detectamos la coexistencia de autofagosomas y autolisosomas y, tras 12 horas de hipoxia, la mayoría de las vesículas autofágicas eran degradativos. Sorprendentemente, encontramos que la autofagia inducida por hipoxia se bloqueaba en animales mutantes para Atg1 o Sima (principal factor de transcripción de los genes involucrados en la adaptación a hipoxia). Por el contrario, la autofagia desencadenada por ayuno no mostró esta dependencia con Sima. Por último, larvas mutantes para Atg1 o Atg3 exhibieron una dramática reducción de la sobreviva al desarrollarse en un ambiente hipóxico, al compararlas con animales salvajes. Estos resultados muestran por primera vez que el estrés hipóxico induce una respuesta autofágica robusta en D. melanogaster, comparable a la inducida por ayuno, siendo éste un mecanismo de adaptación a la hipoxia, dependiente de Sima y Atg1.