Implicancias del gen FMR1 en la función ovárica

Abstract

El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXA en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarca aproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kb que puede sufrir splicing alternativo. En su región 5 no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican en normales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200 repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completa es la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desorden neurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, que se acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajos niveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesis multicausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causas iatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1% en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 es responsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de la premutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeres portadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelven menopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeres portadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellas enfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudios genéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ovárica asociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de las repeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. De hecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200 repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no se conoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ovárica y la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial del número de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codifica este gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo, se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARN mensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que un aumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a una haploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución del pool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismos alternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efecto tóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estos mecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteína en el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largo del desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestro trabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y su mensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranos y ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) para enriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en los distintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de la granulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea al folículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados: preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tipos foliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión en estadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformas de la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo y cerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamiento post-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en los niveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica para algunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1 en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión era opuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fue menor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión del mensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblemente independiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existencia de varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas, detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de la introducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células de granulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendo tripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en las células que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observado en diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidad de células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todos los tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos en la célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletes en el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, los resultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en un futuro. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de su mensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas, producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes a demostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células del ovario.

The FMR1 gene, responsible for the Fragile X Syndrome (FXS), is located in the FRAXA site of chromosome X. The gene is composed of 17 exons, spans about 38 kb and encodes an messenger RNA (mRNA) of 3.9 kilobases (kb) that can be alternatively spliced into a number of different isoforms. The 5’ UTR of the FMR1 gene presents a CGG repeat that is unstable and therefore variable. Based on the size of the expansion, alleles are classified as normal (5–44 trinucleotide repeats), intermediate (45- 54 repeats), premutated (55–200 repeats), or fully mutated (>200 repeats). While full mutation is the responsible for FXS, the premutation condition has been associated to other 2 clinical disorders: Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), a neurodegenerative disorder of late onset and to the Fragile X- associated primary ovarian insufficiency (FXPOI). Primary ovarian insufficiency (POI) is defined as amenorrhea (for at least 4 months) before age of 40, an increase in serum levels of FSH (to menopausal levels) and low levels of estradiol (hypoestrogenism). This syndrome is very heterogeneous with a multicausal pathogenesis, and any of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberration may be the cause of the disease. It has an incidence of 1% in women under age of 40 and of 0.1% below 30 years of age. FXPOI is the most common known genetic cause for IOP and the premutation condition is responsible for 4-6% of all cases of 46, XX IOP. About 2% of women 46, XX with IOP and 14% of women 46, XX with familial IOP, carry the premutation in the FMR1 gene. Moreover, it has also been described that around 20% of women carrying the premutation, become menopausal around 5 years earlier than not carriers. The premutation status seems to influence the expression of the disease. In fact, no full mutated women with IOP have been described. While not all women carries of the permutation experience an early loss of fertility, all carriers face the potential advance in the onset of the conditions associated with estrogenic deficiency (higher risk for osteoporosis and hearth diseases). Epidemiologic genetic studies also suggest that the onset and severity of ovarian dysfunction associated to FXPOI is variable, and could be potentially modulated by the CGG repeat length and environmental factors. Even though the underlying mechanism by which the FMR1 premutation is responsible for the ovarian dysfunction and POI is not known, it has been suggested that an initial decrease of the number of follicles or an accelerated rate of atresia may take place. The protein encoded by the FMR1 gene, FMRP, is highly expressed in germ cells in the fetal ovary. The protein acts as a translation inhibitor of some target mRNA, most likely via the microRNA silencing complex. Given that in FXTAS an increase in FMR1 mRNA has been observed, another possible mechanism for FXPOI is that high levels of mRNA exert a toxic effect causing an increase in follicular atresia. None of the postulated pathogenic mechanisms has been demonstrated in the ovary. Moreover, the physiological role of FMRP in the gonad has not been established, and the expression pattern of the protein during follicular growth remains unknown. Considering that there is limited information related to FMR1 expression and function in the ovary, the goal of our work was, initially, to study the expression of FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. For this propose, three groups of rats were used: 1- prepubertal rats of 18 days, 2- prepubertal rats of 21-23 days treated with Diethylstilbestrol (DES) to enrich ovaries with early antral follicles and 3- prepubertal rats of 21-23 days treated with equine chorionic gonadotropin (PMSG) to enrich ovaries with preovulatory follicles. The expression of FMRP in the rat ovarian follicular cells was analyzed by immunohistochemistry (IHQ) and Western blot (WB). By IHQ we found that the protein is expressed in granulosa, theca and stromal cells, except in a group of cells surrounding the follicle, mainly in the cytoplasm. Expression was detected in follicles at all stages of folliculogenesis: preantral, early antral and preovulatory. After WB assays, lower expression in preantral follicle was detected, whereas higher levels of FMRP were observed in later stages of folliculogenesis. Moreover, at least 4 isoforms of the protein were detected whose expression pattern differed from that observed in testis and brain. Considering FMRP’s function as part of the post -transcriptional silencing complex, these results may suggest that the differences observed at FMRP expression levels, could exert a role in the proper development of the follicle. Furthermore, the presence of distinctive isoforms in the ovary could imply a specific function for some of them in de gonad. In the second part of the work we studied the messenger RNA (mRNA) expression of Fmr1 in the three follicular development stages. Using quantitative RT-PCR (qRT-PCR) we found that the mRNA expression pattern was opposite to that observed for the protein: in preovulatory follicles, mRNA level was lower compared to earlier stages. These results suggest that mRNA and protein expression in the ovary may be regulated at different and perhaps independent levels. In addition, by RT-PCR and subsequent sequencing, we identified several messenger isoforms resulting from alternative splicing. Among them, we detected the variant including exon 12, which has not been previously described in other rat tissues so far analyzed. The last aspect we addressed in our work was the biological effect that the CGG repeats in the permutation range could exert on a human ovarian granulosa cell line (KGN). Cells were transfected with a plasmid containing repeats in the normal or in the premutation range cloned upstream of the GFP reporter gene. After different times of transfection, mRNA of the reporter gene was measured by qRT- PCR. We found that after 18 hours, the levels of mRNA was higher in cells transfected with the repeats in the premutation range comparing to the levels found for those with the normal one. These results are in agreement with the observations reported for FXTAS patients and for animal models of the syndrome. Moreover, when cells were transfected with the permutated plasmid, we detected fewer cells expressing the GFP protein in all the transfection times assayed. In neurons, the permutation state has been associated with possible apoptotic effects in the cell. Even though our preliminary studies do not yet show that transfection of KGN cells with the premutation plasmid results in increased apoptosis, the results obtained in the present work open the possibility for this mechanism to be analyzed in a future. In conclusion, this work describes, for the first time, the expression of the FMRP protein and its messenger during folliculogenesis in a rat model. Moreover, the presence of some distinctive isoforms resulting from the alternative splicing of the gene in the ovary is also described. Although we found an increase in mRNA levels and reduced protein expression of the reporter gene containing permutated repeats, further studies are needed to elucidate the pathogenic mechanism of the expanded triplets in the ovary.