Caracterización de las propiedades fotoquímicas y fotosensibilizadoras de cloroharminas. Evaluación de las implicancias biológicas y potenciales aplicaciones biotecnológicas

Abstract

Las β-carbolinas (βCs) son un grupo de heterocíclos nitrogenados derivados del 9H-pirido[3,4-b]indol o norharmano que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, formando parte de los componentes normales de una gran variedad de sistemas biológicos (animales, plantas, insectos, etc.). La estructura química de estos alcaloides es sumamente variada y, en particular, se han descripto numerosas βCs halogenadas asiladas en invertebrados marinos, algas y cianobacterias entre otros organismos. Estas βCs halogenadas han sido descriptas como compuestos bioactivos. In vitro se ha demostrado que tienen capacidad citotóxica contra varias líneas celulares. Algunos de estos compuestos muestran actividad antimicrobiana contra parásitos, virus, levaduras y bacterias. Se ha especulado que la función de estas βCs halogenadas en la naturaleza está relacionada con cuestiones de presión ecológica. Se sugirió que la presencia de estos compuestos en cianobacterias les confiere ventajas ecológicas al disuadir a los predadores debido a su potencial neurotoxicidad. Además, la actividad inhibidora de proteasas podría estar dirigida a organismos fotosintéticos que compiten por la luz, provocándoles la muerte por inhibición de enzimas claves de la fotosíntesis (efectos alelopáticos).Lo cierto es que, a pesar de su abundancia y biodistribución, el principal rol biológico, así como muchos aspectos fundamentales de los mecanismos implicados en las funciones conocidas permanecen pobremente entendidos. Esto ha despertado un gran interés en el estudio de las propiedades fisicoquímicas de las βCs halogenadas y, en particular, de su comportamiento fotoquímico. Cabe aclarar, sin embargo, que, con anterioridad a esta Tesis, la descripción del comportamiento fotoquímico y fotofísico en medio acuoso, que es relevante desde un punto de vista biológico, no se ha realizado.En este contexto, se llevó adelante el presente trabajo de Tesis Doctoral, titulado: ?Caracterización de las propiedades fotoquímicas y fotosensibilizadoras de cloroharminas. Evaluación de las implicancias biológicas y potenciales aplicaciones biotecnológicas?. En el mismo se exploran aspectos básicos de la fotoquímica y fotofísica de tres cloroharminas (6-Cl-Ha, 8-Cl-Ha y 6,8-diCl-Ha), en solución acuosa y se las compara con la estructura no sustituida Ha. También, se evalúa la interacción y la capacidad de fotosensibilización al ADN (incluyendo cinéticas de clivaje a ADN plasmídico y caracterización de fotoproductos), junto con la capacidad (foto) tóxica y (foto)mutagénica de estos alcaloides. Finalmente, se exploran dos aplicaciones biotecnológicas basadas en parte de los conceptos desarrollados y resultados obtenidos en los capítulos 2 y 3. En este sentido, se evaluan, en primera instancia diferentes métodos de atenuación fotodinámica de Toxoplasma gondii (como modelo de parásito intracelular obligado) basados en el uso de distintas radiaciones (UVC, UVA y visible) y agentes fotosensibilizadores. Por otra parte, se investiga la biocompatibilidad de diferentes Polímeros Microporosos de Coordinación (PMC), junto con su capacidad y potencial uso como matrices para el transporte de agentes fotosensibilizadores y/o de reconocimiento selectivo del parasito T. gondii. Las conclusiones generales más relevantes de este trabajo de Tesis se detallan a continuación: i) Los estudios de investigación básica o fundamental sobre diferentes procesos en los que participan estos alcaloides proveen información cuali y cuantitativa relevante desde el punto de vista biológico, útil para comprender el rol biológico de estos alcaloides y/o sugerir posibles funciones biológicas. Brevemente: A diferencia de lo observado para otras βCs investigadas con anterioridad a la realización de esta Tesis, las cloroharminas presentan una eficiencia de producción de 1O2 relativamente elevada (ΦΔ~ 0,2). Esta propiedad apoya, en términos cuantitativos, la hipótesis de que ciertas βCs podrían tener un rol activo en los mecanismos fotoiniciados de defensa contra organismos invasores via ERO, sugerido para diferentes sistemas biológicosAsimismo, las cloroharminas mostraron ser agentes secuestradores de 1O2 muy eficientes (ktΔ~ 107- 108M-1cm-1). Esta particularidad hace de las cloroharminas, buenos candidatos para actuar como agentes antioxidantes en sistemas vivos sometidos a condiciones de estrés oxidativo. Se demostró que, en condiciones de pH fisiológico, si bien ambas especies coexisten en el equilibrio, debido al efecto del atomo de cloro como sustituyente del anillo β-carbonilico central, las especies neutras (N) de las cloroharminas están presentes en más de 60%o 70%. También se demostró que, en general, las especies N muestran una cierta inestabilidad relativa en soluciones acuosas (reacciones de sustitución y/o hidrólisis), siendo los 8-cloroderivados los que muestran una cinética de degradación térmica mayor. Mas aún, se especuló que en dicho proceso el átomo de hidrógeno unido al nitrógeno indólico (N-9) tendría un rol activo como entidad estabilizadora ya sea del del grupo saliente Cl- o de las entidades atacantes (HO- o H2O). En este contexto, es relevante destacar que muchos de los derivados clorados de esta familia de alcaloides aislados y caracterizados en la naturaleza (tales como Bauerina) presentan un grupo metilo como sustituyente en la posición N-9. Consecuentemente, este tipo de sustituciones podría actuar, en la naturaleza, como una respuesta protectora a la hidrólisis térmica característica de estos cloro-derivados.Por otro lado, las cloroharminas demostraron ser un grupo de compuestos fotoquímicamente activos, incluso en condiciones de anaerobiosis, con una elevada capacidad fotosensibilizadora. Teniendo en mente, además, que debido a la presencia de los átomos de cloro en su estructura, estos alcaloides presentan mayor capacidad de absorción en la región del visible y de su capacidad de participar en procesos de absorción bifotónica, se hace evidente que las cloroharminas aquí investigadas son buenos candidatos para futuras investigaciones y desarrollos en terapia fotodinámica.Por otro lado, esta Tesis abordó en profundidad el estudio de la capaciad fotosensibilizadora de cloroharminas sobre material genético (ADN). La relevancia de comprender las bases moleculares de las lesiones inducidas en el ADN por agentes fotosensibilizadores endógenos y/o exógenos radica en su fuerte impacto en la salud humana, debido a su relación directa con los procesos de mutagénesis y carcinogénesis. Además, desde un punto de vista biomédico, la producción controlada y selectiva de lesiones es una herramienta prometedora para el diseño y desarrollo de nuevos agentes fototerapeuticos basados en nuevas estrategias de daño. Por ejemplo, la PDT utiliza usualmente la vía tipo II de fotosensibilización (via la generación fotosensibilizada de 1O2). Este hecho representa una clara limitación en aquellas enfermedades que exhiben condición de hipoxia tales como los tumores sólidos. Por lo tanto, el uso de cromóforos capaces de llevar a cabo una fotosensibilización de tipo I y/o ataque hidrolítico del ADN, tal como las cloroharminas, pueden ser vistos como una vía para superar las condiciones de hipoxia.ii) Desde un punto de vista de aplicaciones biotecnológicas,  En relación a la atenuación del parásito Toxoplasma gondii, los estudios del efecto de la radiación incidente sobre el tipo y magnitud de daño inducido en el parasito muestran una fuerte dependencia con la naturaleza (energía) de los distintos tipos de radiación utilizada (UVC, UVA y visible). Cada tipo de radiación induce una colección de daños distintivos que los vuelve ideales para aplicaciones variadas. En particular, UVC induce un daño generalizado en la estructura del parásito conduciendo, rápidamente, a su inactivación y muerte. En este sentido, este tipo de radiación es ideal para procesos de esterilización y erradicación del parásito. Por su parte, las radiaciones UVA y visible, ambas modificaciones selectivas que conducen, en términos generales a la inhibición fotosensibilizada (por cromóforos endógenos y/o exógenos, tales como el rojo de fenol proveniente del medio de cultivo) en la capacidad de invasión y replicación, respectivamente. Esta atenuación selectiva se vuelve adecuada para su uso potencial en diversas aplicaciones. Un ejemplo de esto, es el desarrollo de vacunas, donde se sabe que la utilización de parásitos vivos es mas eficiente que las vacunas basadas en parásitos muertos. Para lograr este objetivo, en la actualidad se emplean rayos γ, rayos X y radiación UVC o como fuente de atenuación. Sin embargo, estas fuentes inducen daños inespecíficos y sin control en múltiples componentes estructurales del parásito, incluyendo los antígenos de membrana. Por lo tanto, otras fuentes de atenuación tales como UVA y la radiación visible, via fotosensibilización, puede ser prometedora.  La capacidad de atenuación fotosensibilizada puede hacerse más efectiva mediante el uso de alcaloides de la familia de las βCs. Se demostró que estos compuestos, en particular Ha, es capaz de fotosensibilizar la inhibición de procesos fisiológicos en microorganismos de manera selectiva, volviéndose así agentes adecuados para su uso potencial como agentes atenuantes en diversas aplicaciones.  Por otra parte, se demostró que los polímeros microporosos de coordinación (PMC) son nanoestructuras ideales para la adsorción y transporte de agentes fotosensibilizadores (βCs). El hecho de que las βCs sean capaces de conservar sus propiedades químicas, fotoquímicas y fotofísicas aún formando parte de estas estructuras, abre un sinfín de posibilidades que van desde su uso per se hasta en terapia fotodinámica. El transporte de drogas mediante nanopartículas permite solucionar numerosos inconvenientes que presentan las drogas libres.