Efecto de nuevas terapias anti-ERBB-2 y ácido retinoico en el movimiento de células de cáncer de mama humano

Abstract

El carcinoma de mama se clasifica en subtipos moleculares de acuerdo a lapresencia/ausencia de receptores de estrógenos (RE), receptor de progesterona y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (ErbB-2, también conocido como HER-2). Los tumores que presentan sobreexpresión de HER-2 son más agresivos y metastásicos, debido a que la señalización a través de este receptor contribuye a la transformación oncogénica, teniendo las pacientes mal pronóstico. Se han desarrollado nuevas estrategias anti-HER-2 que se utilizan actualmente en la clínica, un anticuerpo monoclonal que se une al dominioextracelular de HER-2 llamado trastuzumab (Tz) o Herceptin®. A pesar de este progreso, entre el 40-60% de los pacientes no responden a la terapia odesarrollan resistencia a la misma. Todo esto, lleva a la necesidad de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos basados en la combinación de distintas drogas. Los retinoides, y principalmente el ácido retinoico (AR) han sido propuestos en el tratamiento adyuvante del carcinoma de mama por su capacidad para inhibir el crecimiento e inducir la diferenciación morfológica o fenotípica. Su actividad antitumoral está mediada principalmente por losreceptores de ácido retinoico (RAR), que pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares. El proceso de adhesión y migración celular es crítico para que la célula se propague, invada y realice metástasis en otro sitio. Moesin induce la despolimerización de la actina y su translocación hacia el borde de la membrana celular, siendo responsable de la formación de complejos corticales de actina. Otra proteína clave es la quinasa de adhesión focal (FAK), la cual participa en el ensamblaje y desensamblaje de los complejos de adhesiones focales, reorganizándolos en la dirección de la migración; su sobreexpresión esta correlacionada con tumores más agresivos. La hipótesis de este proyecto es que la combinación de trastuzumab (Tz) y ácido retinoico (AR) tiene un efecto sinérgico en la disminución de la viabilidad, adhesión y migración de células de cáncer de mama humano HER-2+/RAR+ mediante modificaciones en la expresión/localización de proteínas vinculadas en el movimiento celular como moesin y FAK. Específicamente proponemos 1) Evaluar el efecto de terapias anti-ErbB-2 en combinación o no con el AR en la viabilidad, adhesión y migración de células de cáncer de mama. 2) Investigar la morfología de células tumorales mamarias, mediante el estudio del citoesqueleto actínico luego de los tratamientos con nuevas terapias anti-ErbB-2 en combinación o no con AR. 3) Identificar el posible mecanismo molecular por el cual las terapias anti-ErbB-2regularían/modularían, la expresión de proteínas vinculadas en procesos claves del movimiento celular como moesin, FAK y el receptor HER-2. Se utilizaron las líneas celulares de cáncer de mama humano SKBR-3 (RE-/HER-2+/RAR+) y BT-474 (RE+/HER-2+/RAR+) para un 90 análisis comparativo, ya que se ha demostrado que el tratamiento con Tz tiene un menor efecto en pacientes que presentan tumores RE+ comparado con las que son RE-. Se realizaron tratamientos durante 72 horas con Tz 1 y 10 μg/ml, AR 10-6 M y la combinación de ambas drogas y luego ensayos de MTT, análisis de interacción farmacológica, inmunofluorescencia, ensayos de adhesión, migración e invasión celular, silenciamientos con ARN de interferencia, uso del inhibidor de FAK y western blot. Se demostró que eltratamiento durante 72 horas con distintas dosis de Tz (0,1 ? 1 ? 10 ? 100 μg/ml) y de AR (10-8 ? 10-7 ? 10-6 ? 10-5 M) disminuye la proliferación celular de manera dosis-dependiente en ambas líneas celulares (Fig. A). En la línea SKBR-3 el tratamiento con Tz 1 ? 10 ? 100 μg/ml en combinación con AR 10-6 M el efecto es sinérgico (Fig. B). Por otro lado, en la línea celular BT-474 el tratamiento con Tz 10 ? 100 μg/ml en combinación con AR 10-6 M ejerce un efectosinérgico a diferencia del tratamiento con Tz 1 μg/ml combinado con AR 10-6 M que genera un efecto aditivo en la disminución de la proliferación celular. El índice de reducción de dosis (DRI), obtenido para la línea SKBR-3 indica que dentro de las combinaciones sinérgicas Tz 1 ?10 μg/ml + AR 10-6 M podemos disminuir 10 veces la dosis de Tz logrando el mismo efecto mientras que para la combinación Tz 100 μg/ml + AR 10-6 M la reducción de la dosis de Tz es de 100 veces (Fig. C). En la línea BT-474, en la combinación Tz 10 μg/ml + AR 10-6 M, la dosis de Tz utilizada es 10 veces menor cuando se lo usa dentro de ésta combinación sinérgica y para la combinación Tz 100 μg/ml + AR 10-6 M, el DRI indica que dentro de este escenario sinérgico el efecto es 100 veces más potente comparado con Tz sólo. La coadministración de las drogas disminuyó con lostratamientos. Mediante inmunofluorescencia se observó que Tz 10 μg/ml, AR 10-6 M y la combinación de ambas drogas, induce la translocación de FAK desde el citosol al núcleo en ambas líneas celulares (Fig. E). Además, se observó una distribución granular del receptor HER-2 luego de los tratamientos combinados (Fig. F). Mediante microscopía confocal pudimos confirmar que en las células control HER-2 se encuentra en la membrana celular y la coadministración de ambas drogas induce la internalización de éstos, en mayor medida en la línea SKBR-3. Los tratamientos combinados de AR y Tz disminuyen fuertemente la expresión de FAK, Moesin y HER-2 (Fig. G). En conclusión, en modelos celulares de cáncer de mama HER-2+/RAR+, la coadministración de Tz y AR, ejercen un efecto sinérgico en la disminución de la proliferación celular, lo que permite reducir las dosis utilizadas, disminuyendo la toxicidad mientras se mantiene la eficacia.Además la coadministración de Tz y AR inducen la relocalización de FAK al núcleo y la disminución de la adhesión/migración/invasión celular en mayor medida en la línea RE-. La internalización y posterior degradación del receptor HER-2 tendría un efecto benéfico al desactivar la cascada de activación de éstas vías altamente oncogénicas. La combinación Tz más AR resultó en una potente disminución de la expresión de las proteínas esenciales para la migración, FAK/Moesin y del receptor HER-2. Estos hallazgos sugieren que la coadministración de ambas drogas, en pacientes con este tipo de cáncer podría contribuir a mejorar su pronóstico y a disminuir los efectos adversosde la terapia debido a que las dosis de Tz aplicadas serían menores gracias al efecto adyuvante de AR.