Caracterización funcional de factores implicados en la protección frente al daño por frío en frutos de durazno

Abstract

Los frutos de duraznero (Prunus persica L. Batsch) y de otras especies de la familia Rosaceae poseen gran importancia agronómica y nutricional. Debido a que su labilidad aumenta rápidamente a temperatura ambiente, el uso de bajas temperaturas (R) es una práctica indispensable para extender su vida comercial. Sin embargo, la fruta se ve afectada por problemas fisiológicos asociados a la refrigeración, conocidos bajo la denominación de daño por frío (CI, chilling injury) y evidenciados al momento del consumo. La aplicación de tratamientos térmicos (TT), entre otros procedimientos poscosecha, ha sido empleada como estrategia para prevenir los síntomas de este desorden, preservando calidad organoléptica y valor nutricional. Adicionalmente, la gran diversidad varietal y su investigación ofrecen importantes herramientas para enfrentar este tipo de problemas productivos. En la actualidad se desconocen en detalle los mecanismos moleculares asociados al daño por frío y a su protección; y, con el fin de identificar determinantes moleculares involucrados en ambos procesos, nuestro grupo ha empleado diversos enfoques ómicos. Transcriptomas, proteomas (total y de apoplasto), metabolomas y lipidoma se han identificado diferencialmente en frutos cv. Dixiland bajo tratamiento térmico y en frutos expuestos a refrigeración de variedades con constrastante susceptibilidad al CI. De esta manera, variadas moléculas se identificaron como putativas protectoras frente a estos desórdenes, siendo fundamental un análisis funcional de las mismas. En la presente tesis, se decidió combinar conocimientos y métodos de biología molecular y bioinformática para identificar y validar determinantes implicados en la protección frente a CI, generando nuevas herramientas que faciliten la búsqueda de variedades de durazno que produzcan frutos con menor susceptibilidad a problemas poscosecha relacionados con dicho daño. Una nueva base de genes de durazno fue creada a partir de las moléculas identificadas por nuestro grupo, con los datos de expresión obtenidos, anotaciones e información derivada de investigaciones con sus ortólogos en otras frutas. Los rasgos de secuencias regulatorias transcripcionales de estos genes de respuesta a TT y/o R fueron analizados en profundidad en cuanto a su contenido, enriquecimiento y arreglo de elementos cis mediante un software de diseño propio, con el fin de definir familias de factores de transcripción putativamente implicadas en los procesos bajo estudio. Elementos cis conocidos en otras especies vegetales, de respuesta a estímulos de temperatura (entre otros) fueron identificados conservados en grupos de promotores coregulados y subgrupos de genes de interés pudieron definirse, permitiendo establecer nuevos actores e hipótesis para descifrar mecanismos subyacentes a las respuestas a temperatura durante la poscosecha. Por otro lado, hemos progresado hacia la caracterización bioinformática y funcional de dos genes reguladores, posiblemente candidatos de la protección frente al daño por frío e identificados previamente. PpZAT12 codifica para un factor de transcripción con dedos de zinc (ZF) de la familia C2H2, como el marcador de estrés sistémico AtZAT12, de la especie modelo Arabidopsis thaliana. Los niveles del ARNm PpZAT12 fueron verificados inducidos luego de TT y al aplicar refrigeración, particularmente en frutos de variedades resistentes al CI. Análisis in silico de las regiones regulatorias permitieron identificar elementos cis clave que condicen con la expresión génica observada, con su participación en múltiples estímulos y a su vez delinean reguladores upstream de ambos transcriptos ortólogos, aunque adicionalmente se identificaron diferencias. Líneas transgénicas 35S::AtZAT12, 35S::PpZAT12 y 35S::PpZAT12/KO-AtZAT12 de A. thaliana presentaron crecimiento y desarrollo retardados, rindiendo plantas de menor tamaño, con floración retrasada y otros rasgos fenotípicos interesantes como presencia de múltiples hojas de roseta curvadas. La regulación de posibles genes target de AtZAT12 en A. thaliana fue confirmada en los genotipos mencionados, por parte de los ortólogos ZAT12. Adicionalmente, un enfoque proteómico fue aplicado para caracterizar péptidos de presencia diferencial en hojas de plantas en floración de los distintos genotipos e implicados en las diferencias fenotípicas observadas. Finalmente, se analizó y definió comparativamente un regulón putativo de ambas proteínas ZAT12. Estos resultados sugieren que el FT PpZAT12 llevaría a cabo un rol protector frente al CI e incluso podría contribuir a los efectos benéficos del TT en duraznos, exhibiendo funcionalidad/es molecular/es similar/es a aquellas de su ortólogo AtZAT12, en A. thaliana. El ARNm PpTRAF, que codifica para una proteína de función desconocida con ZFs tipo TRAF (Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor), pertenece a los transcriptos diferencialmente inducidos en duraznos luego de TT. Se observaron niveles aumentados del mismo luego del almacenamiento refrigerado y se determinó su presencia en otros órganos de duraznero. La localización subcelular del producto génico PpTRAF fue determinada nuclear y citosólica mediante fusión traduccional al reportero fluorescente CFP y agrotransformación transitoria en hojas de N. benthamiana y estable en A. thaliana. Dos ensayos de complementación in vivo en cepas de E. coli particulares fueron utilizados para verificar su funcionalidad como ARN chaperona a bajas temperaturas y actividad de anti-terminación de la transcripción, destacando su posible participación en el metabolismo de ARN vegetal. A modo de profundizar estos estudios, el órtologo de PpTRAF en A. thaliana, AtTRAF, fue caracterizado comprobándose similitudes importantes en cuanto a su localización y funcionalidad como ARN chaperona, respecto a su ortólogo de duraznos. Genotipos con ganancia y pérdida de función de AtTRAF fueron obtenidos y fenotipados en relación a sus respuestas frente estímulos de temperatura y otros de interés. Se verificaron un comportamiento positivo en la velocidad de elongación de raíces y uno negativo en la germinación frente a bajas temperaturas para el genotipo mutante KO-AtTRAF respecto a Col-0, mientras que las líneas 35S::AtTRAF respondieron de forma opuesta bajo las mismas condiciones. Adicionalmente, KO-AtTRAF demostró un comportamiento similar luego del estímulo por la fitohormona ABA. Estos resultados sugieren que PpTRAF y AtTRAF poseen una nueva arquitectura con rol ARN chaperona, sumando a la diversidad estructural y de mecanismos de acción de este grupo heterogéneo de proteínas. Los rasgos conservados entre estos ortólogos de P. persica y A. thaliana, sugieren la importancia de su participación en el metabolismo del ARN en diversas respuestas vegetales y de diferentes órganos a la temperatura, incluidas el daño por frío y su protección en frutos de durazno. A modo de conclusión general, los resultados obtenidos en la presente tesis sugieren que procesos moleculares conservados pueden desarrollarse en respuesta a estímulos de temperatura en frutos de P. persica y diversos órganos de A. thaliana, permitiendo a las células aclimatarse y/o resistir en contra de desórdenes agronómicos indeseados como el daño por frío.

Harvested peaches (Prunus persica L. Batsch) and several Rosaceae fruits are agronomically and nutritionally important food products. As they deteriorate quickly at ambient temperature, refrigeration is needed to prevent the rapid fruit decay and to extend shelf life, allowing transportation and marketing. However, cold storage (CS) can generate chilling injury (CI), a group of physiological disorders which affects fruit quality. A particular symptom of CI disorder is called woolliness, and it is characterized by a lack of juiciness and a mealy texture. Many post-harvest approaches were developed to prevent CI, being heat treatment (HT) prior to CS a proven efficient strategy that does not compromise fruit organoleptical quality. Additionally, the natural diversity and its understanding offer important tools to face these agronomic problems. To address the molecular mechanisms associated to CI and find indicators of tolerance, our group has performed several omics approaches. The differential transcriptome, proteome, metabolome, lipidome and apoplast proteome were determined in HT-treated peaches as well as in CS fruits of cultivars with contrastant susceptibility to CI. Many types of molecules were identified as having putative positive roles against CI in peach, and their functional characterization is of interest. With this background, we decided to combine bioinformatics and molecular biology approaches in order to identify and validate genes with protective features against CI, aiming to develop new tools to select cultivars with lower levels of CI-susceptibility. A novel gene database was developed with peach genes previously identified in our lab, grouping expression data, functional annotations and ortholog-derived information in order to begin their characterization. The cistrome of these HT- or CS-responsive genes were deeply explored with an own design software regarding their occurrence, position and enrichment, to create clusters of genes with different requirements at their transcriptional initiation and define important families of transcription factors that could be implied at the molecular level. Several known cis-elements were found conserved in clusters of coregulated promoters and new clusters could be defined, suggesting new key players and leading to new hypothesis regarding the importance of certain TF families in the post-harvest temperature responses under study. On the other hand, we started and progressed towards the bioinformatic and functional characterization of two candidates for CI-protective genes that could act as regulators of different mechanisms involved in gene expression. PpZAT12 is a C2H2 Zinc Finger (ZF) protein that could fulfill roles as transcription factor (TF), as the reported systemic stress marker AtZAT12 from A. thaliana. RT-qPCRs showed that its mRNA levels were induced by HT and CS in peaches of CI-tolerant cultivars. Both 35S::AtZAT12 and 35S::PpZAT12/KO-AtZAT12 A. thaliana transgenic lines had impaired growth and development, rendering small plants (compared to Col-0) with flowering time delay and with other interesting phenotypic features as curved leaves. Several known targets of AtZAT12 were confirmed as regulated by both orthologue proteins at the transcriptional level and a proteomic approach was applied to decipher the peptides that could be responsible of the observed phenotypes, sampling at flowering time. We also aimed to define PpZAT12 targets in peaches based on transcriptomic information from AtZAT12-overexpressing Arabidopsis plants which had augmented freezing tolerance. These results indicate that the TF PpZAT12 could have a protective role against CI and may also contribute to achieve HT effectiveness in P. persica, exhibiting similar molecular functionalities than AtZAT12 in A. thaliana under cold stress. PpTRAF mRNA, encoding a TRAF-type ZF protein with unknown function, belongs to the group of heat-treatment induced identified transcripts in peaches cv. Dixiland. Augmented transcript abundance was also verified in fruits of several cultivars after cold storage and its presence determined in other organs of peach tree. The subcellular localization of PpTRAF protein fused to a fluorescent reporter protein was determined in transient N. benthamiana and stable A. thaliana systems to be nuclear as well as cytosolic. Moreover, a molecular function as an RNA chaperone under low temperatures and against transcription anti-termination could be experimentally attributed to PpTRAF gene product through in vivo complementation assays in bacterial cells, suggesting its involvement in different processes of RNA metabolism. In order to deepen these studies, PpTRAF orthologue from A. thaliana, AtTRAF, was experimentally characterized verifying similar functional features and subcellular localization. Gain- and loss-function AtTRAF genotypes were obtained and phenotyped, regarding their ability to germinate and to elongate their roots under temperature shifts, as well as under other stimuli. These experiments showed that AtTRAF could have particular (positive or negative) roles in different thale cress physiological processes as root elongation and germination under temperature stimuli. Additionally, a similar response was observed for KO-AtTRAF when exposed to ABA. Overall, TRAFs belong to a novel class of RNA chaperones with a particular arquitecture and conserved molecular roles that could be related to temperature-driven responses, from peaches to thale cress. In conclusion, the results obtained here suggest that conserved molecular processes could act under heat and cold stimuli in P. persica fruits and several organs of A. thaliana, allowing the plant cells to acclimate and to resist against undesired agronomic disorders, such as chilling injury.