Resistencia a carbapenemes mediada por metalo-β-lactamasas en bacilos gram-negativos no fermentadores: plataformas genéticas responsables de su diseminación

Abstract

La emergencia de cepas resistentes a los β-lactámicos en bacilos Gram-negativos (BGN) incluyendo enterobacterias y bacilos no fermentadores (BNF) como Pseudomonas spp. y Acinetobacter spp. causa un impacto significativo en infecciones hospitalarias provocadas por clones multirresistentes (MR). El principal mecanismo de resistencia en BGN es la inactivación de β-lactámicos mediante la acción de enzimas denominadas β-lactamasas (Bush, 2018). Entre las distintas clases de -lactamasas, las carbapenemasas revisten la máxima importancia clínica, dado que hidrolizan carbapenemes, -lactámicos de última generación, que suelen ser la última opción terapéutica para pacientes con infecciones por BGN MR (Queenan y Bush, 2007). Esta familia de enzimas está constituida por serino--lactamasas (SLs) así como por metalo--lactamasas (MLs) (Queenan y Bush, 2007). Estas últimas revisten una enorme relevancia clínica debido a su extendido espectro de acción, ya que son capaces de hidrolizar todos los -lactámicos (a excepción del aztreonam), a su asociación con otros genes de resistencia y a que aún no cuentan con inhibidores de uso clínico (Nordmann et al., 2012; Zhao y Hu, 2015). Al presente, al menos 11 familias de MβLs adquiridas han sido descriptas siendo las de tipo-IMP, -VIM y -NDM mayormente detectadas a nivel mundial en cepas clínicas de BGN (Zhao y Hu, 2015; Mojica et al., 2016; Wu et al., 2019). Estas enzimas constituyen un mecanismo de resistencia con elevada implicancia epidemiológica debido a la asociación de sus genes codificantes a diversos elementos genéticos incluyendo plásmidos, integrones, secuencias de inserción y transposones, generando un desalentador escenario clínico, al cual se han referido como de ?catástrofe clínica? (Cornaglia et al., 2011). En este contexto, en este Trabajo de Tesis se han caracterizado plataformas de diseminación de genes de resistencia emergentes, como blaVIM-2 y blaNDM-1, evaluando asimismo los eventos involucrados en el ensamble y transferencia de dichas plataformas. Para ello, se han seleccionado como modelos de estudio especies ambientales del grupo de BNF productoras de MβLs de impacto clínico, como Pseudomonas grupo putida productoras de VIM-2 y Acinetobacter bereziniae, de NDM-1, bajo la hipótesis de que estas especies actuarían como nexo entre nichos ambiental y clínico, constituyendo así reservorios de genes de resistencia.Trabajos previos del laboratorio abordaron la caracterización preliminar de las plataformas genéticas de movilización de blaVIM-2 en 12 aislamientos clínicos de P. putida, identificados por VITEK-2, los cuales son portadores de los integrones/transposones tipo-Tn402. En este trabajo se profundizó la caracterización y localización de dichas plataformas así como aquellas presentes en aislamientos no estudiados previamente, P. putida HB157 y P. aeruginosa HV868 por constituir este aislamiento clínico la primer cepa local de la especie productora de VIM-2. Para ello, inicialmente se abordó la caracterización taxonómica de los 13 aislamientos de P. putida basada en MLSA, empleando secuencias parciales de ARNr 16S, gyrB y rpoD, según esquemas propuestos para grupos o complejos de Pseudomonas spp. Este análisis identificó 7 especies de P. grupo putida, incluyendo las especies P. putida (aislamientos # BA9115 y BA7908) y P. monteilii (#HB157 y BA9713); especies nuevas propuestas por Mulet y cols., como P. grupo putida/II (#LA1008 y HE1012); P. grupo putida/IV (#LD209, HP613, HB313 y BA7816); P. grupo putida/I (#HP813); P. grupo putida/V (#BA9605); así como una nueva especie asignada aquí como P. grupo putida/VII (#LA111). Así, la caracterización molecular permitió distinguir una variabilidad de especies filogenéticamente relacionadas. Análisis de identidad clonal de aislamientos clínicos de la misma especie mediante OD-PCR, pusieron de manifiesto a su vez una totalidad de 11 clones diferentes, lo cual permitió identificar la diversidad genética de la colección de aislamientos bajo estudio. La caracterización molecular de las plataformas portadoras de blaVIM-2 reveló la presencia de integrones/transposones tipo-Tn402 en todos los aislamientos en estudio. Entre ellos, se detectaron dos elementos estrechamente relacionados entre sí, ambos con la maquinaria de transposición completa, que incluye módulo de transposición (tni) e IRs flanqueantes, los cuales fueron designados Tn6335 y Tn6336. El primero de ellos fue hallado en 7 especies diferentes de P. grupo putida incluyendo P. putida (#BA7908), P. monteilii (#BA9713), P. grupo putida/I (#HP813), P. grupo putida/II (#LA1008 y HE1012), P. grupo putida/IV (#LD209, HP613 y HB313), P. grupo putida/V (#BA9605) y P. grupo putida/VII (#LA111); así como en P. aeruginosa (#HV868); mientras que Tn6336 fue hallado en las especies P. putida (#BA9115) y P. grupo putida/IV (#BA7816). La estructura genética del Tn6335 incluye al integrón In41, el cual posee en su región variable blaVIM-2-aacA4, mientras que Tn6336 incluye al In899, cuya región variable contiene solo blaVIM-2. La tercer estructura caracterizada fue la plataforma de P. monteilii HB157, la cual mostró un transposón tipo-Tn402 incompleto portador del In528 siendo su estructura IRi-intI1-dhfrB-aacA4-blaVIM-2-tniC-IS6100. El conjunto de resultados reveló la prevalencia de integrones/transposones tipo-Tn402 relacionados entre sí en diferentes especies de P. grupo putida así como en la cepa de P. aeruginosa incluida en el estudio, lo cual sugiere la transferencia de estos elementos genéticos entre diferentes especies de Pseudomonas. Estos resultados motivaron así el análisis de los mecanismos involucrados en la diseminación de dichos transposones.El análisis taxonómico efectuado en este trabajo de las cepas bajo estudio permitió reconocer que la movilización de blaVIM-2 mediante ensayos de transferencia de ADN previamente realizados en el laboratorio, se halla esencialmente ligada a plásmidos conjugativos de amplio rango de hospedador, que son transferidos entre las diferentes especies de P. grupo putida. Ensayos de transferencia de ADN realizados en este trabajo para aislamientos previamente no caracterizados, P. monteilii HB157 y P. aeruginosa HV868, mostraron que en esta última especie, blaVIM-2 se encuentra localizado en un plásmido replicativo en P. aeruginosa aunque no en E. coli. Ensayos posteriores de restricción de los extractos plasmídicos, y secuenciación nucleotídica en casos seleccionados, revelaron que los plásmidos derivados de P. grupo putida/II HE1012 (pHE1012); P. grupo putida/IV HB313 (pHB313) y BA7816 (pBA7816); y P. grupo putida/V BA9605 (pBA9605) tienen una arquitectura similar respecto a plásmidos controles empleados derivados de P. grupo putida/IV, y de P. grupo putida/VII (pLD209 y pLA111, respectivamente), secuenciados previamente. Estos resultados pusieron de manifiesto la identidad de los mismos, denominados por ello plásmidos tipo-pLD209; resultados que indican la circulación de los mismos por diferentes cepas así como entre diferentes especies de P. grupo putida. Análisis de localización de las plataformas portadoras de blaVIM-2 según ensayos de digestión del ADN genómico con S1 o XbaI/PFGE y ensayos de hibridación permitieron determinar la portación cromosomal de blaVIM-2 para P. putida BA9115 y BA7908, P. monteilii HB157 y BA9713, P. grupo putida/I HP813, P. grupo putida/II LA1008 y P. grupo putida/IV HP613, como así también confirmar la portación de blaVIM-2 en plásmidos tipo-pLD209 en los restantes aislamientos de P. grupo putida. Para el caso de P. aeruginosa HV868, la banda de elevado tamaño molecular según S1/PFGE correspondería al plásmido conjugativo resultante de ensayos de transferencia de ADN. Por último, la evaluación de los sitios de inserción del Tn6335 en cromosoma de P. grupo putida/IV HP613 y P. grupo putida/II LA1008 revelaron que el mismo se encuentra interrumpiendo el sitio res de transposones tipo-Tn501 y tipo-Tn1403, respectivamente; agregando así evidencias de que sitios res de transposones tipo-Tn3 son blancos de elección para la inserción de transposones tipo-Tn402, e.g. Tn6335. Aun así, resultados de ensayos de clonado y secuenciación mostraron la inserción del Tn6335 en cromosoma, en diferentes regiones del sitio res respecto a reportes de otros transposones tipo-Tn402, mostrando nuevos sitios blancos específicos de inserción.Los resultados en conjunto revelaron que plásmidos tipo-pLD209 constituyen el principal elemento de transferencia intra-específica de blaVIM-2 según su hallazgo entre clones pertenecientes a la misma especie, e.g. #LD209, y BA7816, correspondientes a P. grupo putida/IV; como de de transferencia inter-específica observado según el hallazgo en P. grupo putida/IV, P. grupo putida/II (HE1012), P. grupo putida/V (BA9605), y P. grupo putida/VII (LA111). Evidencias de eventos de transposición intra-específicos han sido observadas, derivadas del hallazgo del Tn6335 en cromosoma y en plásmido de aislamientos clonales de la misma especie, e.g. Tn6335 en las cepas clonales P. grupo putida/IV HP613 y LD209; respectivamente. Evidencias similares de portación de Tn6335 en cromosoma y en plásmido han sido observadas para cepas diferentes de la misma especie, e.g. P. grupo putida/II LA1008, P. grupo putida/II HE1012, respectivamente. El conjunto de resultados de este trabajo señalan la capacidad de diferentes especies de P. grupo putida para intercambiar plásmidos conjugativos (tipo-pLD209), y/o movilizar intra-genómicamente transposones completos portadores de blaVIM-2, constituyendo estas estructuras integrones/transposones, al presente escasamente reportadas, y quizás subestimadas como elementos genéticos de transferencia de genes en el género Pseudomonas. El hallazgo de un plásmido conjugativo en P. aeruginosa (diferente a los tipo-pLD209), portador del Tn6335 aporta evidencias de que especies de P. grupo putida, serían reservorios ambientales de genes de resistencia, y responsables de la transferencia de plataformas de resistencia a patógenos nosomiales (como P. aeruginosa). Estos resultados muestran que diferentes miembros de P. grupo putida pueden constituirse en un nexo entre bacterias ambientales y clínicas. La emergencia de cepas productoras de NDM, asociada a infecciones de elevadas tasas de morbi-mortalidad es actualmente una grave problemática de Salud Pública (Wu et al., 2019). En este contexto, la diseminación de blaNDM-1 en enterobacterias así como en Acinetobacter baumannii ha sido reportada profusamente (Dortet et al., 2016). Sin embargo, el rol de especies ambientales, e.g. A. bereziniae, como reservorios de genes de resistencia de impacto clínico no ha sido dilucidada y es materia de estudio en este trabajo. Se evaluó así la capacidad de una especie de Acinetobacter, infrecuentemente asociada a la clínica, para el ensamble de plataformas genéticas capaces de movilizar genes de resistencia a antimicrobianos (e.g. blaNDM-1) entre bacterias ambientales y patógenos nosocomiales. Asimismo, ha sido un objetivo específico la caracterización del contenido plasmídico de la cepa de A. bereziniae tomada como modelo de estudio, bajo la idea de dilucidar los elementos genéticos que facilitan la supervivencia de estas bacterias en diferentes nichos (ambiental/clínico). El aislamiento clínico HPC229, preliminarmente identificado como Acinetobacter lwoffii, fue caracterizado en base a los marcadores ARNr 16S, gyrB y rpoB, por lo cual fue reasignado a la especie A. bereziniae. La caracterización molecular de la plataforma portadora de blaNDM-1 en HPC229 mediante técnicas de biología molecular así como secuenciación mostró que blaNDM-1 se encuentra asociado al transposón compuesto Tn125, el cual a su vez se halla inserto en un plásmido no conjugativo, de 44 kpb, denominado pNDM229. Pudo reportarse así el primer aislamiento de A. bereziniae productor de NDM-1 en América y el segundo de esta especie reportada en el mundo (Brovedan et al., 2015). La comparación nucleotídica de pNDM229 contra plásmidos relacionados hallados en A. lwoffii y A. bereziniae (pNDM-BJ01 y pNDM-40-1, respectivamente) mediante herramientas bioinformáticas mostró que pNDM229 presenta semejante esqueleto plasmídico que dichos plásmidos, perteneciendo así al grupo de plásmidos denominados tipo-pNDM-BJ01 (Jones et al., 2015). Sin embargo, pNDM229 muestra características únicas, como el hallazgo de una segunda copia de tipo-ISAba14 corriente abajo del Tn125, por lo cual conformaría un transposón compuesto flanqueado por dos copias de ISAba14, lo cual podría proveer capacidad de movilizar no sólo a blaNDM-1, sino también a apha6, codificante de una aminoglucósido-acetiltransferasa; y deleciones en genes esenciales del Sistema de Secreción tipo IV (SST4) (e.g. virB8-virB11 y virD4) lo que explicaría la falla en la recuperación de transconjugantes. Bajo el objetivo de evaluar la diseminación de blaNDM-1 mediante plásmidos tipo-pNDM-BJ01 en el género Acinetobacter se realizaron estudios comparativos de la secuencia nucleotídica de pNDM229 contra bases de datos de Acinetobacter spp. Los resultados revelaron la existencia de 21 plásmidos tipo-pNDM-BJ01, y otros 5 plásmidos con esqueletos diferentes; reportados en numerosas especies de Acinetobacter. Entre estos últimos, la región de homología correspondiente a la región de adaptabilidad resultó ser el Tn125 o parte del mismo. El alineamiento de esta región para el conjunto de los plásmidos tipo-pNDM-BJ01 incluyendo pNDM229, reveló plataformas diferentes, que evidencian rearreglos genéticos. Estas variaciones incluyen esencialmente deleciones del Tn125, o bien adquisiciones de ISs, que conforman transposones compuestos potencialmente movilizables (e.g. ?Tn14? de pNDM229). Sin embargo, se presentan regiones conservadas en ambos extremos de la misma e involucra en el extremo 5? la estructura ISAba14-aphA6-ISAba125-blaNDM-1-ble; y en el extremo 3?, el gen codificante de la resolvasa TnpR así como una región intergénica de 160 nt corriente arriba del mismo. Por último, la búsqueda sistemática de estructuras ancestrales putativas en Acinetobacter spp. mostró regiones homólogas a ambas conservadas descriptas, en cepas de A. parvus y de A. pittii. Así, se propone un modelo hipotético que sugiere que la transposición del Tn125 sería una de las últimas etapas, la cual dio origen al plásmido pNDM-BJ01 detectado en A. lwoffii, a partir del cual derivan restantes plásmidos tipo-pNDM-BJ01 (como pNDM229). Este modelo aporta evidencias de que especies ambientales de Acinetobacter serían responsables del ensamble de estructuras potencialmente móviles (como plásmidos tipo-pNDM-BJ01), y por tanto agrega evidencias de que especies ambientales del género constituyen reservorios de genes de resistencia.La secuenciación y caracterización de plásmidos co-residentes con pNDM229 en la cepa clínica A. bereziniae HPC229 permitió distinguir regiones de replicación, estabilidad, transferencia y adaptabilidad en los plásmidos denominados pAbe229-114, pAbe229-15, pAbe229-9, pAbe229-4 y pAbe229-1 (por sus tamaños moleculares). Las comparaciones contra bases de datos mostraron que son plásmidos no reportados previamente. No obstante, regiones parciales fueron detectadas en diversos plásmidos de Acinetobacter spp., evidenciando así regiones expuestas a THG entre diferentes especies de Acinetobacter. El análisis de pAbe229-114 (114 kpb) reveló un esqueleto plasmídico similar al hallado en pAV3, derivado de una cepa ambiental de A. venetianus, dada la homología de las regiones de replicación y estabilidad. Sin embargo, pAbe229-114 presenta regiones únicas que incluyen un SST4 incompleto de elevado contenido GC (57%), lo cual sugiere su adquisición desde otro género bacteriano (e.g. P. stutzeri); y numerosos genes involucrados en la resistencia a metales pesados, a estrés oxidativo como así también a bacteriófagos. La detección de numerosos elementos genéticos incluyendo islas genómicas, ISs y transposones revelan una larga historia de rearreglos genéticos. La estructura general de los plásmidos pAbe229-15 (15 kpb) y pAbe229-9 (9 kpb) resultó ser semejante, constituyendo plásmidos movilizables dado que poseen una región de transferencia mobA-oriT. Aun cuando la región de adaptabilidad es característica para cada uno de ellos, ambos tienen en común numerosos sitios de recombinación XerC/D, bordeando módulos de replicación, transferencia y adaptabilidad, lo cual sugiere la movilización de dichas regiones por eventos de recombinación mediados por sitios XerC/XerD. El análisis de pAbe229-4 (4 kpb) mostró que, a pesar de no contener genes codificantes de replicasa y relaxasa, posee un sistema TA que le otorga estabilidad. Por su parte, el análisis de pAbe229-1 (1 kpb) reveló un plásmido de reducido tamaño sin características funcionales conocidas, y constituye el elemento de menor tamaño reportado al presente en Acinetobacter spp. La clasificación de los plásmidos de HPC229 se basó en la comparación de las secuencias aminoacídicas de las replicasas, así como también en los últimos 300 AA del extremo N-terminal de sus relaxasas. Las replicasas de pAbe229-114, pAbe229-15 y pAbe229-9 están incluidas dentro de los ?Acinetobacter Rep-3 Groups? (AR3G) descriptos, i.e. AR3G4, AR3G3 y AR3G6, respectivamente. Por otro lado, las relaxasas de pAbe229-15 y pAbe229-9 así como de pNDM229 se clasificaron en el subgrupo MOBQ1, mientras que la relaxasa de pAbe229-114 forma parte de un grupo filogenético diferente, MOBP111. Aun cuando ninguno de los plásmidos de HPC229 se muestra conjugativo según análisis in silico, la presencia de relaxasas en estos últimos sugiere su potencial movilización. Plásmidos portadores de blaNDM-1, como pNDM229 de la cepa local y pNDM-40-1 de la cepa clínica A. bereziniae CHI-40-1 han sido reportados. Sin embargo, al presente hay escasos datos del genoma accesorio de esta especie. En este contexto, se caracterizó aquí in silico el contenido plasmídico de genomas depositados de cepas de A. bereziniae. Para ello, se efectuó la búsqueda sistemática de marcadores plasmídicos en 7 genomas disponibles, así como de dos cepas aquí asignadas a esta especie mediante la herramienta bioinformática orthoANI (Acinetobacter Ag2 y WC-743). Se identificaron 16 replicasas, 7 en CHI-40-1; 4 EN 507_ABAU; 3 KCTC 23199; 2 en CIP 70.12; y 1 en WC-743, Ag2 y NIPH3, que agruparon en 11 de los 15 grupos caracterizados de AR3G, descriptos en Acinetobacter spp. Por otro lado, se detectaron 8 relaxasas, 6 en CHI-40-1, y 1 en 507_ABAU y WC-743, las cuales clasifican dentro de los grupos MOBQ1 y MOBQaci. Como resultado del análisis global, se destaca que las cepas clínicas portadoras de blaNDM-1, HPC229 y CHI-40-1, contienen elevado número de replicasas y relaxasas, mostrando la diversidad de plásmidos que albergan las únicas dos cepas clínicas MR de esta especie, con genomas completos (Jones et al., 2015; Brovedan et al., 2016). Por último, se realizaron búsquedas de sitios de recombinación XerC/D en los genomas de A. bereziniae bajo el objetivo de identificar módulos potencialmente intercambiables, bordeados por dichos sitios. Para ello, inicialmente se efectuó la búsqueda sistemática de dichos sitios en los plásmidos de HPC229, mostrando 5 en pAbe229-15; 4 en pAbe229-9; 2 en pAbe229-114; 1 en pAbe229-4; y ninguno en pNDM229. Diez de estos sitios tienen una región central (cr) de 6 nucleótidos de longitud lo que llevó a generar un consenso para los sitios XerC/D en A. bereziniae HCP229. Empleando este consenso, se identificaron luego 55 putativos sitios en los genomas de las cepas de la especie; 31 en CHI-40-1, 7 en 507_ABAU, 5 en Ag2, 4 en WC-743, 3 en KCTC 23199, y 2 en las cepas CIP 70.12 y NIPH3 y 1 en XH901. Los resultados mostraron que las cepas clínicas portadoras de blaNDM-1, CHI-40-1 y HPC229, son las que contienen mayor número de sitios. Estos resultados sumados a lo expuesto anteriormente sugieren una correlación entre cepas adaptadas al entorno hospitalario con la presencia de diversidad de plásmidos, así como numerosos sitios XerC/D en sus secuencias nucleotídicas que aportan plasticidad a módulos de plásmidos, y a plásmidos en sí mismos, para su intercambio y diseminación a través de recombinación sitio-específica y/o formación de cointegrados. Los resultados globales de la caracterización de los plásmidos de la cepa clínica A. bereziniae HPC229 muestran que la portación de una diversidad de elementos genéticos le permiten mayor adaptabilidad y supervivencia en diferentes hábitats incluyendo nichos ambientales como clínicos, constituyendo así esta especie un nexo probable entre diferentes grupos bacterianos.