Antagonismo y efecto biocontrolador de Trichoderma spp. sobre Drechslera teres, agente causal de la "mancha en red" de la cebada (Hordeum vulgare L. var. vulgare)

Abstract

La Argentina es el mayor productor de cebada destinada a la industria maltera de Sudamérica, llegando en el año 2015 a 3,4 millones de toneladas. Entre las enfermedades más importantes que afectan el cultivo de cebada se encuentra la “mancha en red”, causada por el patógeno fúngico Drechslera teres. Esta enfermedad produce pérdidas en promedio del 20%, afectando el peso y número de granos y la calidad de malta para la elaboración de cerveza. El patógeno D. teres sobrevive de una temporada a la siguiente en los restos culturales de la campaña anterior y en semillas infectadas, siendo estos sus principales fuentes de inóculo. Es por ello que es necesario priorizar su manejo para evitar su propagación y dispersión. En el marco del manejo integrado de enfermedades, el biocontrol, mediado por microorganismos con propiedades antagonistas, es una medida tendiente a disminuir la carga inicial de inóculo permitiendo niveles tolerables de enfermedad. Este manejo conlleva a una disminución en las aplicaciones y dosis de fungicidas químicos, lo que reduce la contaminación y la generación de resistencia de los agentes fitopatógenos. El objetivo de la presente tesis fue realizar estudios de biocontrol sobre el patógeno D. teres con aislamientos nativos de Trichoderma spp. en el marco de la búsqueda de estrategias sustentables para el control de la “mancha en red” en la Argentina. Para esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1)- Aislar cepas de Trichoderma spp. y de D. teres provenientes de distintas áreas productora de cebada de la Argentina . 2)- Caracterizar morfológica y molecularmente los aislamientos 3)- Analizar la interacción de ambos microorganismos in vitro e identificar los mecanismos biológicos y bioquímicos que intervienen en dicha interacción. 4)- Evaluar el efecto de Trichoderma spp. en ensayos in vivo y determinar su eficiencia como biocontrolador de D. teres. El patógeno D. teres se aisló de hojas de cebada con el síntoma típico de “mancha en red” provenientes de cultivos de la Estación Experimental Julio Hirschhorn (Los Hornos, Buenos Aires) y de semillas infectadas naturalmente de diferentes regiones productoras de cebada de la provincia de Buenos Aires: Barrow, Bolívar, Bordenave y Tres Arroyos. Trichoderma spp. se aisló a partir de muestras de rizósfera del mismo origen que las semillas de cebada. Se seleccionaron 3 cepas de D. teres (D. teres A; D. teres C y D. teres M) y 8 de Trichoderma spp. (T0, T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) que se caracterizaron morfoculturalmente y filogenéticamente. El análisis molecular se realizó con el marcador ITS para D. teres y Tef1 para Trichoderma spp. Los análisis confirmaron la identidad del patógeno, mientras que para el agente antagonista, permitieron diferenciar los aislamientos obtenidos en dos grupos taxonómicos: siete de ellos (T2, T3, T4, T7, T8, T9 y T10) se agruparon dentro del complejo de especies T. harzianum y uno (T0) dentro del clado T. longibrachiatum. Se evaluó la capacidad antagónica in vitro de los 8 aislamientos de Trichoderma frente al patógeno D. teres. Para esto se realizaron cultivos duales en los que se registró el porcentaje de inhibición miceliar del patógeno y se realizaron observaciones de la zona de interacción mediante microscopía óptica y microscopía de fluorescencia confocal. Durante la confrontación en los cultivos duales, se observó que D. teres produce una pigmentación rojo-anaranjada en la zona de interacción con Trichoderma spp. Se procedió a la extracción y caracterización de los pigmentos mediante medidas de absorbancia en el espectro UV-visible, espectrofluorometría y cromatografía en capa fina (TLC). Además, los pigmentos fueron purificados por Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC) y se analizaron mediante Resonancia Magnética Nuclear (NMR) para determinar sus identidades. Las observaciones en los cultivos duales mostraron que todos los aislamientos de Trichoderma spp. inhibieron el crecimiento micelial de D. teres en un rango del 18% al 54%. El aislamiento T3 fue el que mejor inhibición produjo con un MGI del 39% al 54%. La pigmentación observada en la zona de contacto de ambos microorganismos se presentó solo durante la confrontación y mostró propiedades fungistáticas. Los mecanismos antagónicos observados microscópicamente en la zona de interacción fueron: micoparasitismo con enrollamiento (coiling), micelio vacuolizado, paredes delgadas sin pigmentación característica (hifas albinas) y micelio deformado. Bajo microscopía confocal se observó autofluorescencia en vesículas citoplasmáticas de D. teres durante la confrontación con Trichoderma spp., sin embargo esta fluorescencia no se evidenció en los cultivos monoespecíficos. A partir de la extracción del pigmento rojo-anaranjado formado durante la interacción D. teres- Trichoderma spp. y del análisis de su espectro UV- visible, se obtuvieron 4 picos de absorbancia de 489, 279, 254 y 230 nm. El espectro de absorción del pigmento observado coincidió según la bibliografía con un tipo de catenarina. Con la técnica de TLC se obtuvieron tres bandas de pigmento, sugiriendo que al menos tres son los pigmentos observados en D. teres durante la confrontación. La coincidencia de los espectros de emisión a 488 nm obtenidos por microscopía confocal y espectrofluorometría indicaron que los pigmentos rojo-anaranjados de la zona de interacción serían los que están presentes en las vesículas citoplasmáticas de D. teres. La comparación de los cromatogramas obtenidos por HPLC de los pigmentos de la zona de interacción y de un estándar de catenarina comercial (1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona) resultaron ser muy similares, mostrando además un alto grado de correspondencia en sus espectros NMR. Todo esto sugiere que al menos uno de los compuestos generados por D. teres durante la interacción sería 1,4,6,8-tetrahidroxi-3-metilantraquinona. Se evaluó la capacidad antagónica de Trichoderma spp. sobre D. teres mediada por compuestos orgánicos volátiles (VOCs) con la técnica de cultivos enfrentados a través de la estimación del MGI del patógeno. Los VOCs liberados por los microorganismos solos y en confrontación se extrajeron mediante la técnica “espacio de cabeza” (HS) y los análisis se realizaron por Cromatografía Gaseosa (CG) y Espectrometría de Masas (MS). La evaluación del MGI mediante la liberación de VOCs por Trichoderma spp. evidenció que todos los aislamientos inhibieron entre 19% y 38% el crecimiento de D. teres, siendo T3 el que presentó mayor porcentaje de MGI, coincidiendo con los resultados para cultivos duales. Se observó albinización en las colonias de D. teres expuestas a los VOCs y sus observaciones microscópicas evidenciaron vacuolización, micelio debilitado y paredes muy finas con respecto a lo observado en los testigos. En el análisis de los perfiles CG-MS de VOCs liberados por los cultivos monoespecíficos de Trichoderma spp. se observó una composición similar entre ellos y al encontrado durante la confrontación con D. teres aunque con algunas modificaciones. De ellos, el mayor porcentaje de los compuestos lo representaron los sesquiterpenos, diterpenos y terpenoides. El aislamiento T0 fue el que produjo mayor abundancia relativa solo y en la confrontación con D. teres. También se observó que la presencia del patógeno estimuló la producción de VOCs en los antagonistas. Se evaluaron los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, en ensayos de invernáculo mediante sus efectos sobre el biocontrol de D. teres y como promotor del crecimiento. Se realizaron ensayos en sustrato estéril (vermiculita) con el fin de seleccionar los mejores aislamientos para ser probados en tierra. Se emplearon semillas de cebada con 30% de infección natural de D. teres, la cual fue considerada escasa por lo que a su vez fueron inoculadas artificialmente con el aislamiento D. teres A. Trichoderma spp se inoculó 24 h. antes de la siembra. Cada tratamiento consistió en semillas de cebada infectadas artificialmente con el patógeno más el aislamiento de Trichoderma spp. a testear. Las variables evaluadas fueron: incidencia (%), severidad en hojas y tallos (%), clorofila (SPAD), peso seco aéreo y radicular (mg). Los ensayos en tierra se realizaron con los aislamientos T0, T2, T3 y T9 que mostraron mayores habilidades antagonistas en cultivo in vitro e in vivo. Todos los aislamientos probados disminuyeron significativamente el porcentaje de incidencia hasta un 53%. La severidad del tallo disminuyó hasta un 77%, siendo los aislamientos más destacados T2, T3 y T9. La severidad en hoja fue disminuida hasta un 70% siendo T0, y T3 los que mostraron menores valores. En cuanto a la variable clorofila, todos los aislamientos presentaron una tendencia hacia valores más altos que el testigo destacándose T0. Para las variables peso seco aéreo y radicular T0 y T3 fueron los que presentaron mayores valores. Con estos datos, se encontró una clara tendencia en la capacidad diferencial de biocontrol entre los aislamientos de Trichoderma spp. que se correspondió con los ensayos in vitro. Esta investigación permitió contribuir al conocimiento de los mecanismos biológicos que intervienen en la interacción D. teres-Trichoderma spp. aún no abordada en la Argentina, para ser aplicados en potenciales prácticas de biocontrol de enfermedades. Se registró por primera vez la producción del pigmento catenarina generado por D. teres durante la interacción con Trichoderma spp. Se determinó que algunos de los aislamientos de Trichoderma spp. probados in vitro, ejercieron control in vivo mediante la disminución de la transmisión del patógeno de semilla a plántula y de la severidad de la enfermedad. Además, se evidenció que Trichoderma mostró una tendencia hacia la promoción del crecimiento y vigorización de las plántulas de cebada, lo que posiblemente confiere ventajas a las plantas y minimiza el impacto negativo causado por factores bióticos y abióticos.

Argentine is the largest producer of barley destined to the malting industry of South America, reaching in 2015 to 3,4 million of tons. Among the most important diseases that affect the barley crops is the “spot net blotch” caused by the fungal pathogen Drechslera teres. This disease produces losses on an average of 20 %, affecting the weight and number of grains and malt quality for brewing. The pathogen D. teres survives from one season to the next in the cultural remains of the previous campaign and in infected seeds, being its main sources of inoculum. That is why it is necessary to prioritize its management in order to avoid its spread and dispersion. In the context of the integrated diseases management, the biocontrol mediated by microorganisms with antagonistic properties is a measure tending to reduce the initial inoculum load, allowing tolerable levels of disease. This management carries to a decrease in the applications and doses of chemical fungicides, which reduces the pollution and the growth of resistance of the phytopathogen agents. The aim of the present thesis was to carry on biocontrol studies on the D. teres pathogen with native isolates of Trichoderma spp. in the framework of the search of sustainable strategies for the control of the "spot net blotch" in Argentine. For this, the following specific aims were proposed: 1) - To isolate strains of Trichoderma spp. and of D. teres from different barley producing areas of the Argentina. 2) – Characterize these isolates, both morphologically and molecularly 3) - Analyze the interaction of both microorganisms in vitro and identify the biological and biochemical mechanisms involved in such interaction. 4) - To evaluate the effect of Trichoderma spp. in in vivo tests and to determine its efficiency as biocontrol agent of D. teres. The pathogen D. teres was isolated from barley leaves with the typical symptom of "spot net blotch” from crops of the Experimental Station Julio Hirschhorn (Los Hornos, Buenos Aires) and of naturally infected seeds from different barley producing regions of Buenos Aires state: Barrow, Bolivar, Bordenave and Tres Arroyos. Trichoderma spp. were isolated from rhizosphere samples of the same origin that the seeds of barley. Three strains of D. teres (D. teres A; D. teres C and D. teres M) and 8 of Trichoderma spp. (T0, T2, T3, T4, T7, T8, T9 and T10) were selected and characterized morphoculturally and phylogenetically. Molecular analysis was performed with the ITS marker for D. teres and Tef1 for Trichoderma spp. The analysis confirmed the identity of the pathogen, while for the antagonist agent it allowed to differentiate the isolates obtained in two taxonomic groups: seven of them (T2, T3, T4, T7, T8, T9 and T10) were grouped within the species complex T. harzianum and one (T0) within the clade T. longibrachiatum. The in vitro antagonistic capacity of the 8 isolates of Trichoderma against the D. teres pathogen was evaluated. For this, dual cultures were performed in which the percentage of mycelial inhibition (MGI) of the pathogen was recorded and observations of the interaction zone were made by optical microscopy and confocal fluorescence microscopy. During the confrontation of the dual cultures, it was observed that D. teres produced a red-orange pigmentation in the zone of interaction with Trichoderma spp. The pigments were extracted and characterized by absorbance measurements in the UV-visible spectrum, spectrofluorometry and thin layer chromatography (TLC). In addition, the pigments were purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and analyzed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to determine their identities. Observations on dual cultures showed that all isolates of Trichoderma spp. inhibited D. teres mycelial growth in the range of 18% to 54%. The T3 isolation produced the best inhibition with an MGI of 39% to 54%. The pigmentation in the contact zone of both microorganisms was observed only during the confrontation and showed fungistatic properties. In the interaction zone, the antagonistic mechanisms observed microscopically were: mycoparasitism with coiling, vacuolated mycelium, thin walls without characteristic pigmentation (albino hyphae), and deformed mycelium. Under confocal microscopy, autofluorescence was observed in cytoplasmic vesicles of D. teres during the confrontation with Trichoderma spp., however this fluorescence was not evidenced in monospecific cultures. From the red-orange pigment extraction and the analysis of its UV-visible spectrum, four absorbance peaks of 489, 279, 254 and 230 nm were obtained. The absorption spectrum of the pigment coincides with a type of catenarin according to previous reports. With the TLC technique, three pigment bands were obtained, suggesting that at least three pigments were present in D. teres during the confrontation. The coincidence of emission spectra at 488 nm obtained by confocal microscopy and spectrofluorometry indicated that the red-orange pigments of the interaction zone would be those present in the cytoplasmic vesicles of D. teres. The comparison of the chromatograms obtained by HPLC of the pigments of the interaction zone and a commercial catenary standard (1,4,6,8-tetrahydroxy-3- methylanthraquinone) were very similar, showing a high degree of correspondence in their NMR spectra. All this suggests that at least one of the compounds generated by D. teres during the interaction would be 1,4,6,8-tetrahydroxy-3-methylanthraquinone. The antagonistic capacity of Trichoderma spp. on D. teres mediated by volatile organic compounds (VOCs) was evaluated with the “facing culture technique” through the estimation of the MGI of the pathogen. The VOCs released by the microorganisms alone and in confrontation were extracted using the head space technique (HS) and the analysis were performed by Gas Chromatography (GC) and Mass Spectrometry (MS). The evaluation of MGI by effect of the release of VOCs by Trichoderma spp. showed that all isolates inhibited growth of D. teres between 19% and 38%, with T3 having the highest percentage of MGI, coinciding with the results for dual cultures. Albinization was observed in the colonies of D. teres exposed to VOCs and its microscopic observations evidenced vacuolization, weakened mycelium and very thin walls, in comparison with controls. In the analysis of VOCs released by monospecific cultures of Trichoderma spp. a similar composition was detected between them and the one found during the confrontation with D. teres ,although with some modifications. Of these, the highest percentage of the compounds were represented by sesquiterpenes, diterpenes and terpenoids. The T0 isolation was the one that produced greater relative abundance only and in the confrontation with D. teres. It was also observed that the presence of the pathogen stimulated the production of VOCs in the antagonists. The isolates of Trichoderma spp. tested in vitro, were evaluated in greenhouse trials by their effects on the biocontrol of D. teres and as a growth promoter. The tests were performed on sterile substrate (vermiculite) in order to select the best isolates to be tested on land. Seeds of barley were used with 30% natural infection of D. teres, which were also artificially inoculated with the strain D. teres A. Trichoderma spp. was inoculated 24 h. before sowing. Each treatment consisted of artificially infected barley seeds with the pathogen plus the Trichoderma spp. isolation to be tested. The variables evaluated were: incidence (%), leaf and stem severity (%), chlorophyll (SPAD), aerial dry weight and radicular (mg). The soil tests were performed with the isolates T0, T2, T3 and T9 that showed greater antagonistic capacity in vitro and in vivo culture. All isolates tested decreased significantly the incidence rate up to 53%. The percentage of stem severity decreased up to 77%, being the most prominent isolates T2, T3 and T9. The percentage of leaf severity was reduced to up 70%, with T0, T2 and T3 showing the lowest values. In respect of chlorophyll variable, the T2, T0 and T3 isolates showed the highest values, differing from the control. For the aerial and radicular dry weight variables, T0 and T3 were the most outstanding. With these data, a clear trend was found in the differential capacity of biocontrol between the isolates of Trichoderma spp, which corresponded with the in vitro assays. This research allowed to contribute to the knowledge of the biological mechanisms involved in the interaction Trichoderma spp. D. teres, to be applied in potential biocontrol practices of diseases. It was determined that some of the isolates of Trichoderma spp tested in vitro, exerted control in vivo by reducing the transmission of the pathogen from seed to seedling and the severity of the disease. In addition, it was evidenced that Trichoderma spp. showed a tendency towards the promotion of the growth and vigorization of the barley seedlings, which possibly confers advantages to the plants and minimizes the negative impact caused by biotic and abiotic stresses. The catenarine pigment generated by D. teres during the interaction with Trichoderma spp. is reported forby the first time in this work.