Uso de la técnica CLARITY para la identificación de marcadores fluorescentes en cortes gruesos de la médula espinal

Abstract

El estudio de las interconexiones que establecen las neuronas entre sí o con las células de la glía es uno de los mayores desafíos de la neurociencia. Los anticuerpos fluorescentes permiten la identificación y localización de diferentes estructuras tisulares. Sin embargo, su uso eficiente requiere de la utilización de cortes delgados de muestras, que constituyen una limitación para el estudio de las interconexiones en el sistema nervioso. Asimismo, un mayor espesor de la muestra limita la penetración de la luz emitida por el microscopio, mientras que la opacidad propia del tejido nervioso debida a su alto contenido lipídico dificulta la adquisición de las imágenes al restringir la resolución de los objetos. La técnica CLARITY (del inglés, Clear, Lipidexchanged, Acrylamidehybridized Rigid,Imaging/Immunostaining/In situ hybridizationcompatible,Tissue hYdrogel) permite subsanar estos inconvenientes.Esta técnica fue adaptada en nuestro laboratorio para el estudio de la médula espinal de rata. De acuerdo con el procedimiento realizado, pudimos obtener un órgano completamente translúcido, estructuralmente intacto y que permitió su procesamiento mediante técnicas de inmunofluorescencia y de lectinhistoquímica sin mayores dificultades. A partir de muestras de más de 1 mm de espesor se obtuvieron imágenes confocales de gran resolución y de mayor penetrabilidad que las que se obtienen utilizando las técnicas de procesamiento convencionales. La implementación de esta técnica en nuestro laboratorio permitirá optimizar la información obtenida a partir de muestras de interés.

The study of the interconnections established between neurons themselves and with glial cells is one of the major challenges of neuroscience. Fluorescent antibodies allow identification and localization of different tissue structures. However, their efficient employment requires the use of thin sections of samples, which constitute a limitation for the study of nervous system interconnections. Likewise, increased thickness of samples limits penetration of the light emitted by the microscope, whereas the opacity of the nervous tissue due to its high lipid content limits the resolution of objects, making the acquisition of images difficult. The CLARITY (Clear, Lipid­exchanged, Acrylamidehybridized Rigid, Imaging/Immunostaining/In situ hybridization­compatible, Tissue hYdrogel) technique makes possible to remedy these disadvantages. This technique was adapted in our laboratory for the study of the rat spinal cord. According to the described procedure we obtained a completely translucid and structurally intact organ that allowed processing through immunofluorescence and lectinhistochemistry techniques without major drawbacks. Confocal images of higher resolution and greater penetrability in comparison with those captured using conventional processing techniques were obtained from more than 1 mm thick samples. The implementation of this technique in our laboratory will improve the information obtained from our samples of interest.