Ensayos de producción, caracterización enzimática y obtención de exopolisacáridos de hongos comestibles lignocelulolíticos patagonicos en sustratos provenientes de desechos herbáceos, agrícolas y forestales

Abstract

Muchos de los hongos lignocelulolíticos de los bosques andino patagónicos poseen un alto valor culinario y, además de ser comestibles y nutritivos, presentan también propiedades medicinales; sin embargo, casi no han sido tenidos en cuenta en la Argentina debido a las dificultades para su cultivo y producción. Los hongos causantes de pudrición blanca son los únicos organismos capaces de degradar la lignina hasta su completa mineralización, lo cual hace de este grupo el único que posee todos los grupos de enzimas necesarios para degradar todos los componentes de la madera, siendo estas de interés para aplicaciones biotecnológicas. Los hongos de pudrición castaña remueven selectivamente celulosa y hemicelulosa de la pared celular, sin alterar mayormente la lignina. La explotación forestal de la región andino patagónica genera desechos de aserríos en gran proporción, en su mayoría de forestaciones de Pinus sp. y de maderas del bosque nativo, los cuales podrían ser aprovechados por estos organismos. Esta tesis aborda diferentes objetivos de estudio centrándose en los hongos comestibles degradadores de la madera y nativos de la Patagonia andina, siendo estos Pleurotus ostreatus, Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina antarctica y Fistulina endoxantha. Los mismos fueron coleccionados durante los otoños de 2013 y 2014 en bosques de Nothofagus dombeyii (coihue), Nothofagus obliqua (Roble Pellín) y Araucaria araucana, luego aislados en medios de cultivo tradicionales y, finalmente, preservados como cultivos puros para el trabajo de laboratorio. Se realizaron ensayos de crecimiento en placa de Petri a diferentes temperaturas, resultando la temperatura óptima de crecimiento miceliar para todas las cepas entre 20-23 ºC. Sin embargo, las tasas de crecimiento de Grifola (0,20 – 0,30 cm/día) y Fistulina (0,07 – 0,10 cm/día) fueron sumamente menores respecto a Pleurotus (0,8 – 1,0 cm/día). Grifola gargal y G. sordulenta presentaron actividad lacasa y celulasa, mientras que P. ostreatus presentó actividad lacasa, MnP y celulasa. En ninguna cepa se detectó actividad LiP positiva.. La decoloración de diferentes colorantes textiles (RBBR -Azul brillante de remazol R-, Xilidina, Verde de malaquita y Azure B) fue utilizada para corroborar la actividad enzimática. Pleurotus ostreatus decoloró todos ellos en las dos concetraciones ensayadas (10 y 50 μM), Grifola gargal y G. sordulenta mostraron degradación efectiva de todos los colorantes a 10 μM. Fistulina spp. degradaron ligeramente RBBR, xilidina y verde de malaquita en 10 μM. A partir de medios de cultivo líquido se realizó la cuantificación de la actividad enzimática. Grifola gargal presentó mayor actividad lacasa, con el máximo al día 45 en medio GPY, siendo de 0,100 UE/ml.. El cultivo líquido de P. ostreatus mostró el máximo de actividad entre el día 20 y 25, alcanzando 0,150 UE/ml. Por otro lado, se evaluó cualitativamente la degradación de diferentes especies forestales mediante técnicas de histoquímica. Con estos datos se pudo seleccionar a la lenga como el mejor sustrato para el cultivo en el caso de las especies de Grifola y Fistulina. No se observaron diferencias respecto a los sustratos usados por P. ostreatus. Gracias a la abundancia de desechos agrícola-forestales de la región, se realizaron formulaciones para la producción de las especies comestibles. El enfoque principal se realizó con las cepas de P. ostreatus que crecen naturalmente en Araucaria con el fin de aprovechar su adaptación a los sustratos resinosos y generar una producción sobre residuos de las plantaciones, aserraderos y/o plantas de procesamiento de Pinus sp., abundante por las forestaciones zonales. Se suplementó el material con residuos de las industrias vitivinícola y cervecera regionales. Las eficiencias biológicas (EB) obtenidas en virutas de pino resultaron superiores por parte de las cepas nativas respecto a la cepa comercial utilizada. Los otros sustratos ensayados fueron virutas de lenga, álamo y paja grámon, en los cuales la cepa comercial arrojó mayores EB. Para evaluar el crecimiento y la actividad lacasa frente a compuestos volátiles presentes en las resinas se cuantificó la biomasa fúngica del cultivo líquido y el diámetro de la colonia. El crecimiento fue menor en los tratamientos con limonelo y δ-3-careno, y prácticamente nulo con 4-carvomentenol, citronelol, y ρ-cimen-8-ol respecto al control (Medio MEA). Por otro lado, la actividad ligninolítica lacasa fue inhibida en todos los tratamientos. Estos datos sustentan la baja producción en los sustratos resinosos como las virutas de Pinus sp. Para complementar esta información y comprender la capacidad degradativa natural de P. ostreatus en A. araucana, se evaluó su capacidad de degradación de los lignanos presentes en la células vegetales, revelando una alta degradación de la mayoría de los compuestos, a excepción de los dos más complejos y recalcitrantes, como son el eudesmin y el secoisolariciresinol-4-metil eter-9´-acetato. El máximo de actividad lacasa en el medio de cultivo sólido a base de A. araucana fue de 0,111 ± 0,067 U/gps y el de MnP de 0,220 ± 0,109 U/gps. Se detectaron diferentes isoenzimas de lacasa con peso molecular de entre 35-41 KDa y 75-92 KDa. Los problemas productivos modificaron el foco de la investigación hacia el sustrato colonizado por las especies de Grifola como fuente de compuestos de interés.. La colonización de los sustratos utilizados (lenga, sauce y pino) fue óptima y estos cultivos se utilizaron para el análisis de la capacidad inmunomoduladora en la línea de macrófagos J774A.1 y de citotoxicidad con líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7), osteosarcoma (SAOS-2) y cáncer de colon (HCT116). En cuanto a los esteroles obtenidos el ergosterol resultó el de mayor importancia. Los ácidos grasos que se detectaron fueron ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido araquídico y ácido behénico. Los polisacáridos de G. gargal sobre madera de sauce presentaron un aumento en el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de óxido nítrico (NO) en una concentración de 50 μg.mL−1. Los efectos citotóxicos más relevantes se obtuvieron con los extractos del micelio de G. gargal y del cultivo en las diferentes maderas sobre la línea de cáncer de colon HCT116. Se realizaron ensayos específicos de degradación del azure B con los hongos de pudrición castaña Fistulina antarctica y F. endoxantha por lo observado en las placas con medio agarizado. Se observó mayor decoloración por parte del micelio, obteniéndose un máximo del 53,65% a las 96 horas.

Many of the lignocellulolytic fungi of the Patagonian Andes forests have a high culinary value and besides being edible and nutritious, they also have medicinal qualities; however they have hardly been taken into account in Argentina due to difficulties of their cultivation and production. Fungi that cause white rots are the only organisms in nature capable of degrading lignin until its complete mineralization. This group is the only one to possess all the enzymes necessary to degrade all the components of the wood, being these of interest for biotechnological applications. “Brown rot” fungi selectively remove cellulose and hemicellulose from the cell wall,. Forest activity and exploitation of the region generates sawmills wastes in great proportion, mostly from Pinus sp. and Nothofagus sp., which could be used by these organisms. This thesis addresses different objectives from edible, native wood-degrading fungi of the Patagonian Andes: Pleurotus ostreatus, Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina antarctica and Fistulina endoxantha. They were collected during autumns of 2013 and 2014 in forests of Nothofagus dombeyii (coihue), Nothofagus obliqua (Roble Pellín) and Araucaria araucana. They were isolated in traditional culture media (malt extract agar) and finally preserved as pure cultures for laboratory work. Plate growth tests were performed at different temperatures, resulting in the optimal growth temperature for all strains between 20-23 °C. However, growth rates of Grifola (0.20-0.30 cm/day) and Fistulina (0.07-0.10 cm/day) were lower than Pleurotus (0.8-1.0 cm/day). G. gargal and G. sordulenta presented laccase and cellulase activity, while P. ostreatus presented laccase, MnP and cellulase activity. No LiP positive activity was detected in any strain. The discoloration of different textile dyes (RBBR, Xylidine, Malachite Green and Azure B) was used to corroborate the enzymatic activity. Pleurotus ostreatus decoloured all dyes in both tested concentration (10 and 50 μM), Grifola gargal and Grifola sordulenta showed effective degradation of all dyes at 10 μM.. Fistulina spp. slightly degraded RBBR, xylidine and malachite green in 10 μM. From the liquid culture media, the quantification of the enzymatic activity. Grifola gargal presented higher laccase activity, with the maximum at day 45, in GPY medium, being 0.100 EU/ml. Liquid cultures of P. ostreatus showed the maximum activity between 20 and 25 day, reaching 0.150 EU/ml. Blocks of forest trees woods were used to qualitatively evaluate the degradation by fungal strains using the following histochemical techniques. With these data, it was possible to detect and select lenga as the best substrate for cultivation in the case of Grifola and Fistulina. No differences were observed with the substrates used by P. ostreatus. Thanks to the abundance of agricultural-forest wastes in the region, formulations were made for the production of these edible species. The main focus was on P. ostreatus, which naturally grows in Araucaria, in order to take advantage of its adaptation to this resinous substrate and to generate a production on plantations residues , sawmills and/or to process plants of Pinus sp., abundant because of the zonal forestations. The material was supplemented with wastes from local wine and beer industries. Results showed that the biological efficiencies on pine sawdust are higher when native strains were used when compared to the commercial strain used as control. The other substrates tested were lenga, poplar and straw chips supplemented with barley from the brewing industry, in which the commercial strain yielded higher EB. To evaluate growth and laccase activity against volatile compounds present in the resins, the fungal biomass of the liquid culture and the colony diameter grown on agar medium were quantified. Growth was lower in treatments with limonelo and δ-3-carene; and practically zero with 4-carvomentenol, citronellol, and ρ-cimen-8-ol compare to the control (MEA medium). Laccase ligninolytic activity was inhibited in all treatments. These data explain, at the least in part, the low yield in resinous substrates such as the Pinus sp. To complement this information and to understand the degradative capacity of P. ostreatus in A. araucana, the capacity of lignans degradation was evaluated,revealing a high degradation of this type of compound, except for the two most complex and recalcitrant such as eudesmin and secoisolariciresinol-4-methyl ether-9'-acetate. The maximum laccase activity in the A. araucana-based solid culture medium was 0.111 ± 0.067 U/gdm and that of MnP was 0.220 ± 0.109 U/gdm. Different laccase isoenzymes were detected in the native strains, with molecular weights between 35-41 KDa and 75-92 KDa. Results of domestication of Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina endoxantha and Fistulina antarctica were not encouraging, since basidiomas were obtained only erratically and production times were too long (greater than 4-5 months).These domestication problems changed the focus to the colonized substrate as a source of compounds of biotechnological interest. This was the case in Grifola species. The colonization of the substrates used was optimal and cultures were used to check inmunomodulatory effects on J774A.1 macrophages line. and cytotoxicity effects with cancer cell lines of breast (MCF-7), osteosarcome (SOAS-2) and colon (HCT116). Among the sterols obtained, ergosterol was the most important. The fatty acids found were palmitic acid, linoleic acid, oleic acid, stearic acid, arachidic acid and behenic acid. The polysaccharides of Grifola gargal cultivated in willow increased reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) at 50 μg.mL−1. The best citotoxic effects in HCT116 cell line were obtained with G. gargal mycelium grown on different sawdust and G. gargal pure cultures. Specific tests of discoloration of the textile dye azure B were performed with the brown-rot F. antarctica and F. endoxantha strains because of observations in the initial screening. Further discoloration by mycelium was observed, obtaining a maximum of 53.65% at 96 hours.