Lactobacillus reuteri y sus compuestos inmunomoduladores: Base para el desarrollo de productos anti-inflamatorios

Abstract

Las bacterias lácticas (BL) poseen numerosas propiedades benéficas para la salud del hospedador, entre las cuales se destaca su capacidad inmunomoduladora y anti-inflamatoria. Aunque la mayoría de los efectos benéficos de los probióticos requieren del contacto directo células-bacterias, algunos informes han demostrado que ciertos compuestos extracelulares secretados por BL, tales como proteínas/péptidos, son capaces de regular ciertas vías de señalización y respuestas celulares y promover así protección contra enfermedades inflamatorias. El objetivo de este trabajo de Tesis Doctoral fue profundizar en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares a través de los cuales compuestos secretados por BL ejercen su actividad anti-inflamatoria mediante el empleo de modelos in vitro e in vivo y establecer las bases tecnológicas para el desarrollo de un producto anti-inflamatorio?.Ensayos in vitro empleando un modelo de células RAW 264.7 desafiadas con lipopolisacárido (LPS), permitió seleccionar a Lactobacillus reuteri CRL1098 por producir un compuesto de naturaleza peptídica en el sobrenadante de su cultivo (LrS 1098) capaz de estimular la producción de IL-10 y disminuir marcadores pro-inflamatorios como TNF-α, IL-6, COX-2, Hsp-70 y óxido nítrico (NO). También se demostró que LrS 1098 disminuye la apoptosis de células RAW 264.7 inducida por LPS.Para identificar los mecanismos moleculares por medio de los cuales LrS 1098 es capaz de modular la respuesta inflamatoria in vitro, se evaluó su acción sobre intermediarios claves de distintas vías de señalización intracelular. Se demostró que LrS 1098 induce la respuesta anti-inflamatoria mediante la activación de la vía ERK 1/2 y a través de la inhibición de la vía de PI3K/Akt y de la translocación de la subunidad p65 del factor NF-κB al núcleo.Para validar las propiedades anti-inflamatorias de LrS 1098, se ajustó un modelo in vivo de daño pulmonar agudo (DPA) inducido por LPS en ratones BALB/c. La administración intranasal de LrS 1098 redujo los parámetros evaluados de daño al tejido pulmonar, disminuyó el reclutamiento de células inmunes a las vías aéreas y la secreción de citoquinas pro-inflamatorias al pulmón. LrS 1098 demostró ejercer una actividad anti-inflamatoria más potente que la dexametasona empleada en el modelo in vivo.Por otra parte, se establecieron los aspectos tecnológicos para el desarrollo de un producto anti-inflamatorio. Se diseñó un medio de cultivo simplificado de bajo costo (medio PETG) para la producción de biomasa por L. reuteri CRL1098 empleando un diseño factorial fraccionario. Se evaluó la influencia de distintos nutrientes y diferentes parámetros (agitación, pH, fase de crecimiento) sobre el crecimiento de este microorganismo. Se formuló también un medio de producción de bajo costo (buffer citrato con el agregado de glucosa) en donde el microorganismo fue capaz de producir el compuesto anti-inflamatorio.Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis Doctoral representan un avance sobre el conocimiento de los mecanismos moleculares de acción de bacterias lácticas. Al mismo tiempo, valida in vivo la capacidad anti-inflamatoria de Lactobacillus reuteri CRL1098 y sienta las bases para el desarrollo de un producto para la prevención y tratamiento de desórdenes inflamatorios.

Lactic acid bacteria (LAB) have several beneficial effects on the host health, which include their immunomodulatory and anti-inflammatory capability. Although most beneficial effects of probiotics require direct cell-bacteria interaction, some reports demonstrated that extracellular compounds secreted by LAB, such as proteins/peptides, are able to modulate signaling pathways and cellular responses; thereby, they promote protection against inflammatory diseases. The aim of this Thesis was to enlarge the knowledge of the cellular and molecular mechanisms involved in the anti-inflammatory activity of lactic acid bacteria secreted- compounds in in vitro and in vivo models. Besides, to determine the technological aspects for the development of an anti-inflammatory product. Using the in vitro model of RAW 264.7 cells stimulated with lipopolysaccharide (LPS), Lactobacillus reuteri CRL1098 strain was selected. The soluble factor (LrS 1098) secreted by L. reuteri was a peptide that stimulates IL-10 production and decreases pro- inflammatory mediators such as TNF-α, IL-6, COX-2, Hsp-70 and nitric oxide (NO). In addition, LrS 1098 reduces apoptosis of LPS-challenged RAW 264.7 cells. To gain insight into the molecular mechanisms involved in the immunoregulatory effect of LrS 1098, its influence on key intermediates of intracellular signaling pathways was evaluated in vitro. LrS 1098 induced an anti-inflammatory response by activating ERK 1/2 pathway, through reduction of PI3K/Akt pathway, and inhibition of p65-NF-κB subunit translocation into the nucleus. To evaluate in vivo LrS 1098 capacity to exert anti-inflammatory effect, a mice model of acute lung injury (ALI) induced by LPS was adjusted. The intranasal administration of LrS 1098 reduced inflammatory lung tissue damage, inflammatory cell recruitment to the airways and secretion of pro-inflammatory cytokines. LrS 1098 exerted a more potent anti-inflammatory activity than dexamethasone used in in vivo model. On the other hand, technological aspects for the development of an anti- inflammatory product were established. A simplified culture medium, named PETG, was designed for L. reuteri CRL1098 biomass production optimization using a fractional factorial model. The influence of several nutrients and different parameters such as agitation, pH and growth phase, on the growth of the microorganism, was evaluated. Finally, a low cost medium was formulated (citrate buffer with the addition of glucose) for the production of the anti-inflammatory compound. The results of this Thesis represent an advance on the knowledge of the molecular mechanisms of action of lactic acid bacteria. In addition, they validate the anti- inflammatory capability of Lactobacillus reuteri CRL1098 in vivo and provide a scientific base for the development of a product for the prevention or treatment of inflammatory diseases.