Estudio del mecanismo de reacción y reconocimiento de sustrato de la metalo-β-lactamasa NDM-1

Abstract

Los antibióticos β-lactámicos son la clase de antibiótico más utilizada. Sin embargo, el uso indiscriminado de antibióticos propulsó la generación de mecanismos de resistencia bacterianos. La diseminación global de esas estrategias entre bacterias de diferentes especies hace que los antibióticos conocidos se tornen ineficientes. Para restablecer la efectividad de los compuestos conocidos, se propone incorporar a los tratamientos inhibidores de los mecanismos de resistencia. El mecanismo más potente y mayormente empleado por las bacterias para hacer frente a la acción de antibióticos β-lactámicos es la producción de β-lactamasas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactama, dejando al compuesto inefectivo. Dentro de estas enzimas se encuentran las metalo-β-lactamasas (MβLs), que son enzimas dependientes de Zn(II), cuya relevancia clínica se debe a su capacidad para hidrolizar eficientemente los antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso, los carbapenemes. Al momento, no se cuenta con inhibidores de uso clínico para estas enzimas. Dentro de las MβLs, las enzimas de subclase B1 son las de mayor relevancia clínica. La enzima B1 New Dheli Metallo-β-Lactamase-1 (NDM-1), es una de MβLs de mayor relevancia clínica debido a su rápida diseminación y eficiente actividad carbapenemasa. Esta enzima posee dos iones metálicos en su sitio activo, ocupando los sitios conocidos como sitios 3H o 1 y DCH o 2. En el presente trabajo se propuso estudiar las características bioquímicas y biofísicas de esta enzima, el mecanismo por el cual cataliza la hidrólisis de carbapenemes y la relación entre la estructura su mecanismo catalítico.Se logró purificar a NDM-1 en forma soluble con buen rendimiento y contenido metálico. Esta enzima mostró ser eficiente al hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La capacidad de unir Zn(II) fue medida por ensayos de competencia frente al quelante colorimétrico PAR. Estos ensayos mostraron que la incorporación de metal ocurre de manera secuencial, siendo mayor la afinidad por el primer ion metálico que por el segundo. Luego de la remoción del metal nativo, la enzima pudo incorporar Co(II) y Cd(II) en ambos sitios metálicos. Ambas proteínas metalo-sustituídas fueron activas, demostrando que estos metales pueden utilizarse como sondas espectroscópicas funcionales en esta enzima. El espectro de absorbancia de la proteína bi-Co(II)-NDM-1 mostró un patrón de 5 bandas de campo ligando (bandas d-d), propias de la coordinación de los iones metálicos en el sitio 3H, y una banda de transferencia de carga metal-ligando, producto de la interacción del Co(II) en el sitio DCH con la cisteína. La incorporación de Cd(II) a NDM-1 fue examinada por RMN de 113Cd(II). En el espectro se visualizaron dos bandas principales y cada una fue asignada a un sitio metálico. Estas señales fueron alteradas al incubar la enzima con el inhibidor de MβLs diseñado por el grupo, L-CS319, denotando que el compuesto interacciona con ambos metales al momento de su unión. Por lo tanto, estas enzimas pueden ser empleadas para estudiar cambios en la coordinación de los metales en el sitio activo durante procesos catalíticos o de unión de ligandos. En una segunda etapa, se estudió el mecanismo de hidrolisis de carbapenemes por NDM-1, utilizando técnicas de cinética rápida y diversas espectroscopias. Los datos obtenidos al estudiar el proceso de hidrólisis catalizado por bi-Zn(II)-NDM- y bi-Co(II)-NDM-1, revelaron que ambas enzimas emplean el mismo mecanismo de reacción. Este mecanismo es ramificado e incluye dos intermediarios de reacción productivos (EI1 y EI2). Sólo EI2 puede dar origen a un complejo EP estable. La formación de este complejo fue estudiada por titulación con sustrato hidrolizado en la enzima sustituida con Co(II). Los productos generados durante la hidrólisis de imipenem se estudiaron por RMN de 1H. En estos ensayos, se evidenció que la protonación era estereoselectiva y se concluyó que cada intermediario de reacción tendría que dar lugar a productos diferentes. La identidad de estas especies fue estudiada por cálculos computacionales. Por esta técnica, se comprobó que podría producirse la acumulación de especies intermediarias con carga negativa, cuya estabilidad dependería de la deslocalización de la carga y de interacciones con los iones metálicos. El pasaje de un intermediario a otro estaría marcado por la pérdida del agua coordinada a puente. Estudios recientes de nuestro grupo con las MβLs B2 Sfh-I y B3 GOB-18 (en su forma mono-metalada), revelaron que la hidrólisis de carbapenemes por estas enzimas cursa por medio del mismo mecanismo de reacción y que durante el proceso se acumulan intermediarios con características espectroscópicas similares a los observados en NDM-1. Estos resultados establecen al mecanismo catalítico como un punto de partida para el diseño racional de inhibidores activos frente a las tres subclases.El sitio activo de las MβLs B1 se encuentra rodeado por dos bucles, nombrados L3 y L10. Se ha reportado que el L3 tendría un papel fundamental en la primera interacción de la enzima con los sustratos y que ayudaría al posicionamiento de los mismos por medio de interacciones hidrofóbicas. Para evaluar la función de esta estructura en NDM-1, se generaron dos variantes en las que se intercambió el bucle nativo por el de enzimas de relevancia clínica de la misma subclase VIM-2 e IMP-1 (nombradas L3VIM y L3IMP), y una tercera variante en la que se insertó un residuo de prolina en la base del bucle (L3Pro). Las propiedades de estas variantes fueron evaluadas in bacteria e in vitro. Las variantes mostraron una disminución en su estabilidad y alteraciones en su afinidad por metal, siendo la variante L3VIM la que más se diferenció de la enzima salvaje. A diferencia de lo esperado, no se observaron grandes cambios en el perfil de sustrato de las variantes, pero si se evidenció una alteración en la acumulación de intermediarios de reacción durante la hidrólisis de nitrocefina y carbapenemes, indicando cambios en el mecanismo de reacción de las variantes. La vida media de los intermediarios fue mayor en L3IMP y menor en L3VIM y L3Pro. Fue posible resolver las estructuras de las enzimas L3IMP y L3Pro por cristalografía de rayos X. La mayor diferencia entre estas variantes fue la posición del L3 que, con respecto a la estructura de NDM-1, se encontraba más cerca del sitio activo en L3IMP y más alejado en L3Pro. Se encontró una correlación directa entre en tamaño del surco catalítico (modulado por la posición del bucle L3) y la acumulación de intermediarios de reacción: mientras más alejado del sitio activo se encontraba el L3, menor era la acumulación de los intermediarios. Este resultado indica que la secuencia de aminoácidos del L3 puede modular la vida media de los intermediarios, afectando el proceso de catálisis enzimática y estableciendo una correlación entre la estructura y la función en NDM-1.