Herramientas virales para la detección e identificación del origen de la contaminación fecal en desechos industriales y aguas residuales domiciliarias

Abstract

Numerosos brotes de gastroenteritis virales alrededor del mundo han sido causados directa o indirectamente por aguas contaminadas. Sin embargo, la calidad microbiológica de las aguas se evalúa mediante indicadores bacterianos que no siempre correlacionan con la presencia de virus patógenos contaminantes. Existe un consenso general sobre la necesidad de utilizar indicadores microbiológicos alternativos, subrogantes de virus patógenos, que se sumen a los actuales. Se han propuesto distintos marcadores virales como indicadores de contaminación fecal y de la presencia de virus en distintas matrices hídricas. El objetivo general de este trabajo es estudiar la contaminación virológica en muestras de aguas superficiales y en efluentes cloacales e industriales, desarrollando metodologías específicas para este fin. En este trabajo se evaluó: - la utilidad de los bacteriófagos F-ARN y de los poliomavirus humanos (HPyV) como indicadores de contaminación fecal/viral, - su comportamiento frente a los tratamientos a los que son sometidos los efluentes y - la correlación con la presencia de un agente patógeno viral (norovirus, NoV), en comparación con los indicadores tradicionales (coliformes termotolerantes). Además, se implementó la detección molecular de HPyV, poliomavirus bovinos (BPyV) y adenovirus aviar (AdV aviar) para determinar el origen de la contaminación microbiana. Se recolectaron 52 muestras de efluentes crudos y tratados de plantas de tratamiento de aguas residuales (WWTP) provenientes de actividades domésticas humanas, mataderos de animales para el consumo (bovinos, equinos), granjas de cerdos y aves de corral y una industria láctea. Además,se recolectaron 12 muestras de aguas superficiales. La cuantificación de los marcadores virales se realizó mediante un ensayo de doble capa de agar para los bacteriófagos, por PCR en tiempo real cuantitativa para los HPyV y NoV y por la técnica del número más probable (NMP) o filtro membrana para los coliformes. Para determinar el origen humano o animal de la contaminación se realizaron PCRs multiplex anidadas de punto final dirigidas a HPyV, BPyV y AdV aviar. Los indicadores bacterianos fueron detectados y cuantificados en todas las muestras de aguas residuales domésticas, industriales y superficiales, con valores mayores a 103 NMP/100 ml en aguas residuales y valores entre 1,60 x 103 a 5,20 x 105 UFC/100 ml en aguas superficiales. Los bacteriófagos alcanzaron títulos de 4,33 x 102 a 4,40 x 104 UFP/ml en los efluentes crudos y 6,33 x 101 a 7,37 x 103 UFP/ml en los efluentes tratados y de 6 a 290 UFP/ml en las aguas superficiales, con escasa detección en los residuos industriales de origen equino. La evaluación de la eficacia de tratamiento en las plantas de aguas residuales domésticas e industriales mostró una tendencia de menor reducción de los bacteriófagos y de los HPyV con respecto a las bacterias indicadoras frente a un mismo tratamiento. En las aguas domésticas, los indicadores propuestos F-ARN y HPyV se correlacionaron significativamente con un patógeno viral humano, norovirus, mientras que el indicador bacteriano no lo hizo, por lo que fueron mejores predictores del comportamiento de los virus patógenos entéricos en dichas matrices. En las aguas superficiales no se encontró ninguna correlación entre las concentraciones de los indicadores virales y bacterianos ni tampoco entre los indicadores y norovirus. Proponemos distintos factores que afectan la dinámica de estos parámetros en aguas superficiales, a diferencia de lo que ocurre en las aguas residuales. Por otro lado, los BPyV fueron detectados con una prevalencia del 100 % en los efluentes del matadero bovino y 66 % en la industria láctea. Los HPyV se encontraron presentes en todas las muestras de aguas domésticas y en 2 muestras del matadero bovino y 1 de las aguas residuales de la industria láctea. El AdV aviar sólo fue detectado en granjas de aves de corral. Análisis de secuenciación demostraron que las detecciones fueron específicas. En cuanto a los bacteriófagos, además de su uso potencial como indicadores virales de contaminación y de eficacia de los tratamientos de efluentes, se analizó su posible rol en la diseminación de genes de resistencia antimicrobiana (GRA) en el ambiente. Se analizaron los alelos de β-lactamasas TEM y CTX-M diseminados en aguas residuales por medio de bacterias o bacteriófagos, mediante detección molecular directa de GRA, sin crecimiento microbiano previo. Los genes blaTEM se detectaron con una alta frecuencia en genomas bacterianos y de fagos, siendo blaTEM-116 el más prevalente, mientras que también se encontró un tipo recientemente descrito, blaTEM-229. Por otro lado, detectamos 4 de los 5 grupos de los genes blaCTX-M (blaCTX-M9, blaCTX-M2, blaCTX-M1, y blaCTX-M25). La detección de algunos de estos alelos fue inesperada según los GRA de circulación regional en patógenos clínicos. La diversidad de CTX-M encontrada en los bacteriófagos sugiere que los fagos podrían usarse como "reporteros" de los GRA que están circulando entre la población bacteriana. En resumen, en este trabajo de Tesis se implementaron diferentes técnicas para evaluar la contaminación viral en aguas residuales y superficiales, se desarrollaron herramientas virológicas para establecer si la contaminación se asocia a un origen humano, bovino o aviar y se abordó la caracterización de los bacteriófagos como vehículos de genes de resistencia antimicrobiana en aguas residuales. La aplicación de estas metodologías en diversas muestras hídricas permitió presentar resultados pioneros en la caracterización de la contaminación viral de aguas en nuestro país, mediante el estudio de virus muy diversos, que tienen como hospedadores al hombre, distintos animales y bacterias.