Identificación de epitopes de Trypanosoma cruzi mediante análisis in vitro de la respuesta inmune celular en pacientes con enfermedad de Chagas crónica

Abstract

La respuesta inmune celular, y en particular la mediada por linfocitos T, juega un rol fundamental en el control de la infección por Trypanosoma cruzi. En pacientes con infección crónica ha demostrado estar relacionada con la progresión desde el estadio asintomático a la cardiopatía chagásica. No obstante, la complejidad del parásito y de su interacción con el sistema inmune del hospedero dificultan la identificación y caracterización de epitopes activadores de linfocitos T. En este contexto, el estudio de la respuesta frente a la infección por T. cruzi es de interés estratégico, y en particular, el uso de métodos novedosos para el análisis de respuesta inmune celular desarrollada por el paciente en la fase crónica de la enfermedad de Chagas podría aportar elementos de valor para el desarrollo de vacunas profilácticas y/o terapéuticas, y el diseño de tratamientos de inmunointervención. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue el estudio de la respuesta inmune de memoria mediada por linfocitos T generada frente a la infección por T. cruzi en humanos, y se abordó mediante dos estrategias complementarias. La primera implicó el desarrollo de un protocolo para la expansión ex vivo de linfocitos T de memoria específicos contra el parásito, a partir de la estimulación in vitro de células de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Chagas crónica, con y sin sintomatología cardíaca. La respuesta específica de los cultivos se midió como proliferación celular y secreción de IFN-γ y GM-CSF. En primera instancia, se logró determinar que cuando la población de partida son células mononucleares totales, la duración de la estimulación inicial con lisado del parásito tiene una relación directa con la expansión (en nuestro caso, indeseada) de linfocitos T vírgenes activados in vitro, que no tienen relación con la respuesta inmune generada in vivo. Partiendo de linfocitos T CD4+ de memoria separados magnéticamente, se demostró que un estímulo inicial con lisado del parásito es ventajoso sobre uno con un mitógeno inespecífico, porque expande selectivamente las células patógeno-específicas, y genera así líneas policlonales con especificidad estable en el tiempo. Adicionalmente, se validó la utilización de linfocitos B autólogos inmortalizados como células presentadoras de antígenos de T. cruzi en ensayos de desafío in vitro. Los resultados destacaron la importancia de la utilización de múltiples métodos de detección para la selección de cultivos con respuesta específica. A partir de líneas policlonales generadas a partir de linfocitos T CD4+ de memoria de un paciente asintomático, se realizó un ensayo de dilución límite para generar líneas monoclonales T. cruzi-específicas, de utilidad inmediata en el estudio de la respuesta T en el contexto de la enfermedad de Chagas. La segunda empleó una estrategia bioinformática de predicción de epitopes, acoplada a validación in vitro por ELISPOT para IFN-γ en muestras de CMN de pacientes con enfermedad de Chagas. Se identificaron 7 secuencias de T. cruzi que son o contienen epitopes T que activan linfocitos T de memoria. Experimentos con eliminación magnética de poblaciones celulares mostraron que esta respuesta involucra a las poblaciones CD4+ y CD8+ . Mientras que tres de los péptidos contienen epitopes ya descritos, los otros 4 contienen epitopes novedosos. Para uno de los pacientes se demostró que las células secretoras de IFN-γ frente a uno de los péptidos tienen un fenotipo predominantemente TCM, que indica la renovación activa de esta población específica in vivo. No se encontró relación entre la respuesta frente a estos epitopes y la existencia de sintomatología cardíaca. Los resultados presentados contribuyen al conocimiento sobre la respuesta anti-T. cruzi mediada por linfocitos T, en especial en cuanto a los linfocitos T colaboradores, un campo de investigación que, al día de hoy, se encuentra sub-explorado.