Fosfohidrolasas aplicadas en biocatálisis y biorremediación

Abstract

Las fosfotriesterasas son esterasas capaces de escindir el enlace P-O y han sido halladas en mamíferos, peces, aves, moluscos y bacterias. Estas enzimas demostraron ser biocatalizadores útiles en la degradación de compuestos organofosforados, siendo estos ampliamente utilizados en la actualidad como pesticidas en agricultura, en jardines y en la industria veterinaria. En particular, en nuestro país el organofosforado clorpirifós es el segundo pesticida más utilizado. Si bien estos pesticidas son muy eficientes, son también altamente tóxicos para mamíferos. Así, la intoxicación por organofosforados se ha convertido en un problema importante en todo el mundo. Considerando lo antes dicho, en el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como primer objetivo el desarrollo de un sistema para la biorremediación de aguas contaminadas con pesticidas organofosforados empleando catalizadores con actividad fosfotriesterasa. Por otra parte y desde el punto de vista de la biocatálisis, como las enzimas no están limitadas a su actividad natural, es posible utilizarlas empleando una variedad de sustratos, pudiendo además catalizar las reacciones en ambas direcciones de su equilibrio termodinámico. Es por ello que las fosfotriesterasas pueden ser aplicadas en el sentido sintético para la obtención de fosfotriesteres, siendo de particular importancia los correspondientes derivados de nucleósidos y análogos. Estos compuestos, conocidos como pronucleótidos, son productos farmacológicamente útiles como antivirales y anticancerígenos ya que inhiben enzimas específicas (transcriptasa reversa, ARN replicasa, ADN polimerasa, IMP deshidrogenasa) o actúan como terminadores de cadena en la biosíntesis de ARN o ADN. En este marco, se propuso como segundo objetivo efectuar una primer aproximación a la síntesis de pronucleótidos a través de reacciones biocatalizadas. A continuación se hará un breve resumen de lo desarrollado a lo largo de cada capítulo del presente trabajo de tesis doctoral:En el capítulo 1, se presenta una introducción sobre biocatálisis y biorremediación. Ambas tecnologías tienen en común el empleo de sistemas biológicos para llevar a cabo una biotransformación. En este marco también se describen las fosfotriesterasas, enzimas de interés y objeto de estudio del presente trabajo, como así también los compuestos organofosforados (usos y tipos) y los análogos de nucleósidos. En el capítulo 2, se describen las metodologías desarrolladas para llevar a cabo la búsqueda, estudio e implementación en los procesos biocataliticos de fuentes microbianas con actividad fosfotriesterásica. Adicionalmente, se detallan los métodos de detección, análisis y cuantificación de los sustratos y productos de cada reacción biocatalizada estudiada.En el capítulo 3, se exponen los resultados obtenidos a partir del estudio de la actividad hidrolítica de seis fuentes bacterianas wild type frente a metil paraoxón. También se muestran los resultados de la optimización de las condiciones de reacción de dichos biocatalizadores, a partir de las cuales se evaluó la actividad fosfotriesterásica frente a diferentes sustratos, seleccionando un biocatalizador capaz de degradar cada uno de los compuestos organofosforados propuestos.En el capítulo 4, se presenta un trabajo realizado en colaboración con el laboratorio de LIGBCM-AVI de la Universidad Nacional de Quilmes que permitió la identificación de dos bacterias aisladas de suelo. Posteriormente, aplicando una metodología rápida y sencilla, se describe el estudio y la optimización de las condiciones de reacción, obteniéndose biocatalizadores capaces de degradar eficientemente sustratos más voluminosos como coroxón, cumafós y clorpirifós, para los que las fosfotriesterasas wild type reportadas suelen tener baja actividad hidrolítica.En el capítulo 5, se presentan los resultados del estudio de los extractos enzimáticos provenientes de los microorganismos estudiados en los capítulos 3 y 4. Adicionalmente tanto las células enteras como dichos extractos fueron inmovilizados por atrapamiento en perlas de alginato de calcio. Tras su ensayo en la hidrólisis de compuestos organofosforados, se seleccionó una forma de biocatalizador inmovilizado que fuera capaz de degradar con mayor eficiencia cada uno de dichos compuestos. Asimismo, se emplearon los biocatalizadores seleccionados para la degradación de paraoxón y clorpirifós en un biorreactor del tipo lecho empacado con los que se alcanzó la degradación completa de dichos compuestos en 56 y 17 h respectivamente. Se caracterizaron los biocatalizadores determinado la posible existencia de problemas de transferencia de masa, como así también su reutilización. En cuanto al biorreactor, se determinó la distribución de los tiempos de residencia y tipo de flujo.En el capítulo 6, con la finalidad de hallar nuevas fuentes de fosfotriesterasas, se presenta el estudio de cuatro hongos, los que fueron capaces de degradar metil paraoxón llevando a cabo la reacción en growing. Además, se determinó que las enzimas responsables de dicha hidrólisis eran extracelulares, por lo que se obtuvieron los respectivos extractos enzimáticos, que se concentraron y finalmente liofilizaron, analizándose su actividad. Se optimizaron también las condiciones de reacción en cuanto a la cantidad de biocatalizador y pH del medio. Finalmente, en el capítulo 7, se describe la búsqueda de alternativas para mejorar los rendimientos obtenidos previamente en nuestro laboratorio en la reacción de transesterificación para la síntesis de 5´-dimetilfosfato de inosina usando como biocatalizador la fosfotriesterasa de Brevundimonas diminuta. Se exploró la actividad sintética de Streptomyces setonii (microorganismo wild type) y de los microorganismos fúngicos estudiados en el capítulo 6, utilizando las condiciones puestas a punto en la reacción de hidrólisis.