El interferón alfa controla la replicación de los alfaherpesvirus bovinos en células nerviosas

Abstract

Los alfaherpesvirus bovinos (BoAHV) tipo 1 y 5 son neuroinvasivos. El BoAHV-5 es el agente causal de meningoencefalitis necrotizante en terneros, mientras que BoAHV-1 solo ocasionalmente se lo asocia con cuadros neurológicos [1]. El ciclo de infección de los alfaherpesvirus se caracteriza por etapas de infección aguda, latencia y reactivación. Las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (GT) son el principal sitio de latencia y la reactivación del virus latente conduce a la transmisión y diseminación viral [2]. La expresión de los receptores tipo toll (TLR) en tejido nervioso de terneros infectados experimentalmente con BoAHV-1 y -5 demostró que los TLR 3 y 7 desempeñan un rol importante en la respuesta a estas infecciones promoviendo la producción de los interferones (IFN) Tipo I: que IFN-α/β Combaten la infección viral directamente inhibiendo la replicación viral en las células infectadas y vecinas e indirectamente estimulando el sistema inmunitario adaptativo, y la de citocinas, para desencadenar las defensas protectoras del sistema inmunitario innato que participan en la erradicación de patógenos [3]. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de la expresión del IFN-α en la replicación de BoAHV-1 y -5 en células neurales estimuladas con agonistas de los TLR3 y 7. Una suspensión de células de neuroblastoma (SH-SY5Y) se sembraron en placas de 24 pocillos con una concentración de 5x105 células/pocillo y se incubaron durante 24 hs a 37º C con 5% CO2, en DMEM/F-12 con 10% SFB, este ensayo se realizó por triplicado. Transcurrido ese tiempo, las células se estimularon durante 1 hora con agonistas del TLR3 (Poly I:C; 10µg/µL) y del TLR7 (Imiquimod; 5µg/µL). Las células se infectaron a una MOI=1 con la cepa Cooper de BoAHV-1, 97/613 de BoAHV-5 y la cepa A663, un recombinante natural entre los dos tipos de virus. A las 0-4, 8 y 24 horas post-infección (hpi) se colectaron sobrenadantes y células para titulación viral en células MDBK. Los títulos se determinaron mediante el método de Reed y Muench y se expresaron como dosis infectiva en cultivo celular (DICC50/mL). Para promover la expresión génica las monocapas de células SH-SY5Y se estimularon con Poly I:C e Imiquimod. El ARN se extrajo a las 6 y 24 hpi. La expresión del mRNA del IFN-α se cuantificó por RT-qPCR, la estimulación se realizó por triplicado y la cuantificación de la expresión génica por duplicado. Se realizaron análisis de varianza y prueba de Tukey para determinar diferencias estadísticas entre los grupos infectados y de control. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05 para todas las pruebas. Los resultados de la cinética viral se analizaron ajustando un modelo lineal general tomando como variable respuesta el logaritmo de la variable explicativa del título viral, la cepa, el tiempo post-infección y la interacción cepa-tiempo. Los datos se presentan como media del error estándar. Durante las primeras 6 hpi, los títulos virales de la cepa Cooper de BoAHV-1 en células sin el tratamiento con agonistas, fueron superiores con respecto a las células tratadas con Imiquimod (p˂0,05). Resultados similares se observaron en las células infectadas con BoAHV-5 y el recombinante natural A663, durante las primeras 3 hpi. Luego de las 8 hpi en células infectadas con la cepa Cooper BoAHV-1 y tratadas con los agonistas de los TLR3 y 7, los títulos virales fueron similares a los observados en las células sin tratamiento e infectadas con BoAHV-1. A las 4 hpi, en las células de neuroblastoma humano infectadas con la cepa 97/613 de BoAHV-5 y el recombinante natural A663 tratadas con los agonistas de los TLR3 y 7 los títulos virales no difirieron con respecto a las células infectadas con BoAHV-5 sin tratamiento como se evidencia en la fig. 1. En la Fig. 2 se muestra que la expresión del IFN-α en células infectadas con cualquiera de las cepas de BoAHV fue superior en las primeras horas de la infección y disminuyó significativamente a las 24hpi (p˂0,05). La expresión de IFN-α fue mayor en las células infectadas con BoAHV-1 en comparación a las células infectadas con BoAHV-5. Se observó una disminución en la replicación viral en las primeras horas de la infección con las diferentes cepas de BoAHV, coincidente con una mayor expresión del IFN-α. Del mismo modo, al disminuir su expresión, se evidenció un aumento de la replicación viral. Por lo tanto, el tratamiento con agonistas de los TLR 3 y 7 disminuye la replicación de los BoAHV-1 y BoAHV-5.