Modelo de cultivo primario oviductal bovino para el estudio de la patogenecidad de Campylobacter fetus fetus y Campylobacter fetus venerealis

Abstract

La campylobacteriosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por Campylobacter fetus fetus (Cff) y Campylobacter fetus venerealis (Cfv). Se caracteriza por producir mortalidad embrionaria y fetal, con alto impacto económico en nuestra región. Si bien es una enfermedad reconocida y estudiada desde hace muchos años, aún se desconocen aspectos de su patogenia. Por tal motivo se han desarrollado diversos modelos de estudio in vitro con el fin de caracterizar la interacción del microorganismo con las células blanco. Con el objetivo de evaluar la patogenicidad de Cff y Cfv sobre las células oviductales bovinas, nuestro grupo de trabajo desarrolló un modelo in vitro consistente en cultivos en monocapa y explantos, basados en órganos reproductivos de hembras bovinas recolectados post sacrificio. Para esto, una vez obtenidos los órganos, se lavaron exteriormente repetidas veces con solución fisiológica estéril y alcohol 70%, para luego separar los oviductos del útero y los ovarios. El procesamiento de los oviductos se realizó de la siguiente manera: primero se retiró el tejido conectivo circundante, luego se enjuagaron en solución PBS estéril y finalmente se obtuvieron las células de la luz oviductal mediante presión mecánica con pinzas de disección. El material obtenido se colocó en PBS y una vez ocurrida la decantación, las células se lavaron y centrifugaron (1500g) en medio D-MEM con antibióticos. Dichas células se colocaron en placas de cultivo celular con el mismo medio y se incubaron en atmósfera con 5% CO2 a 37 °C. Luego de 48 h de incubación, se recolectó el medio de todos los pocillos para recuperar las células oviductales ciliadas que se mantienen en flotación. Estas fueron lavadas y centrifugadas (1500g), una alícuota fue resembrada en las mismas placas de las que se extrajeron para constituir el cultivo en monocapa; el resto del material fue colocado en otras placas de cultivo, para conformar los explantos oviductales en suspensión. Los ensayos sobre las monocapas en semiconfluencia se dividieron en dos: a) adhesión y b) citopatogenicidad. Sobre los explantos oviductales sólo se realizó el ensayo de adhesión. En ambos casos se trabajó con tres grupos: uno inoculado con Cff, otro con Cfv y un control sin inocular. Los ensayos de adhesión consistieron en una incubación de las células con las bacterias por 24h y posterior tinción con Giemsa e inmunofluorescencia directa. Para los ensayos de citopatogenicidad se realizó el seguimiento con observaciones diarias en microscopio invertido hasta las 72h post inoculación, finalizando con tinción Giemsa. Los resultados obtenidos permitieron comprobar que ambas subespecies se adhieren a las células en los explantos oviductales y en las monocapas, en éstas últimas además causan lesiones, como redondeamiento, formación de vacuolas y desprendimiento. Se concluye que el modelo de cultivo primario oviductal es apto para estudios de adhesión y patogenicidad de Campylobacter fetus y podría ser aplicado en otros microorganismos.