Estudios estequiométricos y cinéticos del crecimiento de Aureobasidium pullulans GM-R-22 en un reactor a escala laboratorio para la producción de una poligalacturonasa (para enología)

Abstract

San Rafael D.O., región vitivinícola del oeste argentino, presenta un microclima especial que contribuye a distinguir sus viñedos y permite la elaboración de vinos mundialmente reconocidos. Las pectinasas son usadas en enología para degradar los polímeros pécticos de la uva, aumentando la extracción de jugo y compuestos de color y aroma atrapados en el hollejo, mejorando el bouquet del vino y las propiedades de clarificación. Actualmente, los preparados pectinolíticos son pooles parcialmente purificados de origen fúngico, que pueden contener impurezas y actividades no deseadas generando un impacto negativo en la calidad del vino. Una alternativa al uso de estos preparados sería la búsqueda de levaduras autóctonas capaces de producir pectinasas aplicables a la vinificación. Aureobasidium pullulans GM-R-22, hongo levaduriforme autóctono de la D.O. San Rafael, presenta capacidad de producir pectinasas activas en condiciones enológicas. Su potencial aplicación en vinificación hace que estudios de crecimiento y producción enzimática a escala de reactor tipo tanque agitado sea necesario en vista de una posible producción a gran escala. Los parámetros cinéticos y estequiométricos del crecimiento de A. pullulans se determinaron utilizando un medio sintético de referencia en un reactor Inceltech LH 210 con 1.5 L de volumen útil. La producción del pool pectinolítico se estudió en el mismo reactor, pero utilizando un medio complejo con pectina cítrica como inductor, y el extracto enzimático resultante se caracterizó bioquímicamente. En el medio de referencia con glucosa como fuente de carbono y urea como fuente de nitrógeno, la velocidad máxima de crecimiento (μmáx) fue de 0.15 h-1. Los rendimientos en biomasa (Yx/s) y en CO2 obtenidos fueron 0.56 Cmol/Cmol y 0.44 molCO2/Cmol, respectivamente. Durante las 29 h de cultivo se consumieron 79.428 mmoles de O2 y se produjeron 70.25 mmoles de CO2. Los balances de carbono y de grado de reducción arrojaron valores cercanos a 1, indicando un metabolismo oxidativo donde no hay productos asociados a la obtención de energía. No se detectó actividad poligalacturonasa (PGasa) en este medio de cultivo. Sin embargo, al utilizar un medio complejo con pectina se constató la presencia de actividad PGasa con un máximo de 1.03 ± 0.05 U/ml a las 29 h. Durante las 29 h de cultivo se consumieron 166.17 mmoles de O2 y se produjeron 121.16 mmoles de CO2, con una μmáx de 0.16 h-1. La caracterización bioquímica parcial del extracto enzimático demostró que el mismo tiene una actividad PGasa óptima a pH 4.0 y 55 ºC. Presenta afinidad por pectinas de diferentes grados de metoxilación, siendo mayor frente a pectina del 92%. El SDS Page acoplado a zimograma muestra una única banda con actividad PGasa de 50 kDa. Este trabajo presenta los primeros resultados a escala de reactor necesarios para el posterior diseño de cultivos a mayor escala y la caracterización bioquímica como herramienta de control de la actividad enzimática obtenida.