Mecanismo molecular de la activación de la síntesis de fosfolípidos por la proto-oncoproteína c-Fos

Abstract

La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el cual c-Fos ejerce este efecto. Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c-Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato. Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA. En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo. En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula. El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína. Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular.