http://hdl.handle.net/11336/73757 Tesis de INST.DE FISIOLOGIA EXPERIMENTAL (I) 2024-06-14T03:40:38Z http://hdl.handle.net/11336/120876 Efecto beneficioso de GLP-2 sobre la expresión y actividad de transportadores ABC intestinales en la endotoxemia experiemental Arana, Maite Rocío La función de los transportadores ABC se ve afectada en varias enfermedades intestinales en los seres humanos, en particular las que cursan con inflamación local o sistémica. En el modelo de inflamación inducido por la administración de LPS a ratas (5 mg/kg de peso corporal por vía i.p.), confirmamos que a las 24 h se produce una disminución en la expresión y actividad de los transportadores Mrp2 y P-gp intestinales. Observamos que LPS, por un lado, disminuyó los niveles de ARNm de ambos transportadores y por otro, produjo la internalización de los transportadores en vesículas endocíticas. Estas observaciones señalan que los cambios a nivel proteico de los transportadores resultan complejos y dependen de una regulación a nivel transcripcional y postranscripcional. Determinamos también que IL-1β media la regulación postraduccional observada para Mrp2. Sin embargo, IL-1β no media la regulación de P-gp, ni la regulación a nivel transcripcional de Mrp2. Recientemente, a GLP-2 le fue asignado un papel clínico como potencial agente terapéutico debido a su capacidad para proteger al intestino en varios modelos de daño intestinal. Nos propusimos entonces estudiar la capacidad de GLP-2 de contrarrestar los efectos del LPS sobre ambos transportadores. Utilizamos dos tipos de protocolos de tratamiento con GLP-2. Uno que evalúe la capacidad preventiva de la hormona, administrándola antes de la inducción de la endotoxemia (7 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. separadas cada 12 h en un total de 72 h consecutivas). Y otro que evalúe la capacidad de GLP-2 de revertir los efectos inducidos por LPS una vez instalados (2 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. comenzando 3 h después de la inyección con LPS). Los resultados muestran que las alteraciones en la expresión y actividad de los transportadores producidas por LPS pudieron ser prevenidos mediante el tratamiento con GLP-2, siendo estos cambios al menos en parte dependientes de una regulación transcripcional. GLP-2 per se indujo los niveles de Mrp2 intestinal tanto a nivel de proteína como de ARNm, mientras que no ocurrió lo mismo para P-gp. En cambio, el tratamiento de reversión con GLP-2 fue ineficiente en recuperar los niveles de Mrp2 y P-gp (proteína y ARNm). En el caso particular de Mrp2, GLP-2 administrado sólo tampoco pudo producir cambios en la expresión de proteínas o ARNm, en contraste con la inducción observada para el protocolo de prevención. Claramente, más de dos dosis de GLP-2 son necesarias para modular la expresión de Mrp2. La observación de que GLP-2 induce Mrp2 a nivel de ARNm sugiere la posibilidad de una regulación transcripcional. GLP-2 actuaría presuntamente mediante su receptor asociado a proteína G, el cual activa adenilato ciclasa. Confirmamos la mediación de AMPc in vivo y en células Caco-2. Estudiamos la posible vía de señalización por la cual GLP-2 induce transcripcionalmente a MRP2 en células Caco-2 tratadas con db-AMPc, un análogo permeable del AMPc. Observamos que db-AMPc activó PKA, que luego fue capaz de activar de forma directa o indirecta por forforilación a ATF-2 y c-JUN. Luego estos factores formaron heterodímeros y se unieron a la región regulatoria proximal (−789/−603) del promotor de MRP2 que contiene sitios putativos AP-1 y CRE. De esta manera db-AMPc aumentaría la transcripción de MRP2 resultando en un aumento de la expresión del transportador en la membrana apical y en un aumento de su actividad. En conclusión, la modulación de estos importantes transportadores de eflujo apicales puede representar un efecto beneficioso adicional de GLP-2 bajo condiciones de inflamación, que contribuyen a restaurar la barrera transcelular, limitando así la absorción de compuestos potencialmente tóxicos.; ABC transporters function is affected in various intestinal diseases in humans, particularly those with local or systemic inflammation. We confirm that at 24 h there is a decrease in the expression and activity of intestinal P-gp and Mrp2 transporters in the inflammatory model induced by administration of LPS to rats (5 mg/kg of body weight by i.p. injection). We observed that LPS decreased the mRNA levels of both transporters and also produced internalization of Mrp2 and P-gp to endocytic vesicles. These observations indicate that changes at transporters protein levels are complex and depend on transcriptional and post-transcriptional regulation. We also determined that IL-1β is involved in the post-translational regulation observed for Mrp2. However, IL1β neither regulates P-gp nor is involved in the transcriptional regulation of Mrp2. Recent reports gave GLP-2 a clinical role as a potential therapeutic agent due to its ability to protect the bowel in various models of intestinal injury. However, no report evaluates the role of GLP-2 in the regulation of the transcellular barrier associated with drug transporters. We then decided to study the ability of GLP-2 to neutralize the effects of LPS on both transporters. Two types of GLP-2 protocols were used. One evaluates the preventive capacity of GLP-2, starting its administration before the induction of endotoxemia (7 s.c. injections of 125 μg/kg b.w. separated every 12 h for a total of 72 consecutive hours). The second protocol evaluates the capacity of GLP-2 to revert the effects of LPS once inflammation is installed (2 s.c. injections of 125 μg/kg b.w. beginning 3 h after LPS injection). The results show that the altered expression and activity of the transporters produced by LPS could be prevented by GLP-2 treatment, due, at least in part, to transcriptional regulation. GLP-2 alone induced intestinal Mrp2 both at protein and mRNA levels, while it did not affect P-gp expression. In contrast, the reversion protocol with GLP-2 was ineffective in recovering Mrp2 and P-gp levels (protein and mRNA). GLP-2 administered alone did not change the expression of Mrp2 protein or mRNA, in contrast to the induction observed for the prevention protocol. Clearly, more than two doses of GLP-2 are necessary to modulate Mrp2 expression. The fact that GLP-2 induces Mrp2 mRNA suggests the possibility of a transcriptional regulation. GLP-2 would presumably act through its receptor associated to G protein, which activates adenylil cyclase. We confirm the involvement of cAMP in vivo and in Caco-2 cells. We studied the possible signaling pathway of GLP-2 that leads to transcriptional induction of MRP2 by treating Caco-2 cells with db-cAMP, a cAMP permeable analog. As a result, db-cAMP activated PKA, which was then able to activate ATF-2 and c-JUN directly or indirectly by phosphorylation. Then these nuclear factors formed heterodimers and bound the proximal regulatory region (−789/−603) of MRP2 promoter which contains putative sites AP-1 and CRE. This way db-cAMP would increase the transcription of MRP2, resulting in increased expression of the transporter in the apical membrane and increased activity. In conclusion, positive modulation of these important apical efflux transporters may represent an additional beneficial effect of GLP-2 under conditions of inflammation, contributing to restoring the transcellular barrier, thereby limiting the absorption of potentially toxic compounds. 2018-03-26T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11336/83983 Participación de AKAP350 en el establecimiento de la polaridad celular en estructuras epiteliales organotípicas y en la sinapsis inmunológica en células NK Almada, Evangelina AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejosproteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi. AKAP350 está implicada en laregulación de la dinámica de los microtúbulos y participa en el desarrollo de la polaridadmigratoria y la polaridad epitelial hepática. En este trabajo se analizó la participación deAKAP350 en el desarrollo de dos tipos de asimetría celular: la polaridad epitelial columnary la sinapsis inmune.En una primera instancia utilizamos cultivos celulares 3D de células epiteliales paraanalizar la relevancia de AKAP350 en el establecimiento y mantenimiento de la polaridadepitelial. Las células con expresión disminuida de AKAP350 (AKAP350KD) formaron quistespolarizados con una morfología anormal del lumen. La organización de células epitelialesen estructuras organotípicas con un único lumen requiere que las divisiones celulares selleven a cabo en forma simétrica respecto al plano del epitelio. Aún no se hancaracterizado completamente las vías de señalización que proveen conexionesmoleculares entre regiones específicas de la corteza celular y los microtúbulos del husomitótico, y que, por lo tanto, definen la orientación del huso mitótico. El análisis de lascélulas mitóticas mostró que las células AKAP350 KD presentaron un alineamientodefectivo del huso mitótico. EB1 es una proteína asociada a los microtúbulos queparticipa en la regulación de la orientación del huso mitótico en células epiteliales.Nuestros hallazgos indicaron que AKAP350 colocaliza en los polos del huso con EB1. Losresultados del análisis de la distancia mínima entre ambas proteínas por FRET fueroncompatibles con la interacción de ambas proteínas en dichas estructuras. Experimentosde co-inmunoprecipitación mostraron la interacción de EB1 con el dominio N- terminal deAKAP350, el cual es también el sitio de unión a la subunidad de la dinactina p150glued. Ladisminución de la expresión de AKAP350 generó una reducción de los niveles de EB1 enlos polos del huso y en los microtúbulos del aster. El aumento en los niveles de EB1 en lospolos mitóticos y en los microtúbulos del aster inducido por sobreexpresión de estaproteína compensó el efecto de la disminución de la expresión de AKAP350 sobre laorientación del huso. La deslocalización específica de AKAP350 del centrosoma, así comola interferencia en su interacción con EB1, indujeron fenotipos similares a los de AKAP350KD, respecto tanto a la localización de EB1 como a la formación del lumen. En estascondiciones también se observó una disminución de los niveles de p150glued en loscentrosomas y en los microtúbulos del aster. Concluimos que AKAP350 recluta a EB1 y2p150 glued a los polos del huso, asegurando la presencia de estas proteínas en losmicrotúbulos del aster y una correcta orientación del huso mitótico durante lamorfogénesis epitelial.Tanto EB1 como AKAP350 participan en la ruptura de la simetría durante elestablecimiento de la sinapsis inmune en célulasT no citolíticas. En una segunda etapa,realizamos experimentos destinados a evaluar la participación de AKAP350 en elposicionamiento de EB1 durante la adquisición de asimetría celular asociada a laformación de la sinapsis inmune citolíticaen células natural killer (Nks). Inicialmentecaracterizamos la presencia de AKAP350 en células YTS, una línea celular proveniente decélulas Nks. A partir de las mismas, se obtuvieron células con la expresión disminuida deAKAP350 (YTS AKAP350 KD). Se utilizó un modelo bien establecido de sinapsis inmunecultivando las células YTS en presencia de células derivadas de eritroleucemia (KT86).Hallazgos de nuestro grupo indicaron que AKAP350 participa en el desarrollo de lapolaridad celular en este modelo. En dichas condiciones, utilizando microscopía confocal,se determinamos que AKAP350 modula la localización centrosomal de EB1. En conclusión,demostramos que AKAP350 modula el direccionamiento del huso mitótico en célulasepiteliales a través del reclutamiento de EB1 hacia los polos y, consiguientemente, hacialos microtúbulos asociados a estas estructuras. En forma similar, AKAP350 también reclutaEB1 hacia el centrosoma durante el establecimiento de la sinapsis inmune citolítica encélulas NK. A través del reclutamiento de EB1 a los polos del huso mitótico, AKAP350interviene en el mantenimiento de la polaridad epitelial planar. La relevancia de lainteracción entre ambas proteínas en la reorganización de las estructuras subcelulareshacia el sitio de contacto con la célula blanco es un aspecto importante a investigar enfuturos estudios. 2018-03-22T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11336/81098 Regulación aguda de la localización y actividad de la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) intestinal por nutrientes Tocchetti, Guillermo Nicolás La proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) es una bomba de eflujo perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC. En el intestino, se localiza en la membrana apical del enterocito y tiene un rol clave limitando la absorción de xenobióticos. La regulación aguda de su actividad a través de cambios en la localización subcelular nunca fue estudiada. En este trabajo hipotetizamos que ciertos nutrientes, una vez que alcanzan la luz intestinal, son capaces de incrementar la densidad de MRP2 en la membrana apical (y por ende su actividad protectora) a través de un mecanismo mediado por la hormona intestinotrófica GLP-2. En la primera parte del trabajo demostramos que la localización y la actividad de MRP2 en sacos intestinales de rata son regulables de forma aguda. Para eso utilizamos estradiol-17β-D-glucurónido y dibutiril-AMP cíclico, dos agentes conocidos por producir internalización e inserción de MRP2 en modelos hepáticos. En la segunda parte del trabajo utilizamos un novedoso modelo in vivo para demostrar que la administración intrayeyunal de ácido oleico es capaz de inducir una inserción de MRP2 en la membrana apical y aumentar su actividad de transporte. Además, mediante diferentes estrategias experimentales, demostramos que GLP-2 es un mediador de ambos efectos, disparando una señal que viaja a través de la pared intestinal y culmina con un aumento en la producción extracelular de adenosina mediada por CD73. En la última parte del trabajo y utilizando la línea celular intestinal Caco-2 demostramos que MRP2 de origen humano también es susceptible de regulación aguda y que el tratamiento agudo con adenosina puede producir inserción y aumento de actividad de MRP2 en este modelo, en un proceso probablemente mediado por el eje A2BAR/cAMP/PKA. En conjunto, estos hallazgos representan un mecanismo fisiológico novedoso orientado a protegernos contra la absorción de tóxicos en períodos absortivos. 2019-02-11T00:00:00Z http://hdl.handle.net/11336/81000 Rol de la aquaporina-8 mitocondrial en la regulación de la biosíntesis hepática del colesterol Danielli, Mauro La aquaporina-8 (AQP8) es un canal transmembrana multifuncional que facilita el pasaje del peróxido de hidrógeno y amoníaco, además de agua. AQP8, como una proteína de 28 kDa no glicosilada, se expresa en la membrana interna mitocondrial de los hepatocitos y algunas otras células. La AQP8 mitocondrial (mtAQP8) del hepatocito puede funcionar como una peroxiporina facilitando la liberación mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2).En hepatocitos, el colesterol puede activar o reprimir genes implicados en su vía biosintética a través de la unión a elementos regulados por esteroles (SRE) de factores nucleares SREBPs. Los SREBPs interactúan con las regiones promotoras SRE de genes que codifican las enzimas colesterogénicas, por ejemplo, la enzima clave 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR). AQP8 ha sido identificado, por análisis de microarrays, como un gen putativo de respuesta a colesterol siendo posiblemente blanco de los factores nucleares SREBP en hígado de ratón. Además, el análisis del promotor del gen de AQP8 indica que también posee elementos de respuesta a los factores nucleares SREBP.Por otra parte, se ha reportado que el H2O2 estimula la síntesis de colesterol mediada por SREBPs en las células hepáticas, así nuestra hipótesis es que mtAQP8, a través de su rol facilitador de la liberación del H2O2 mitocondrial (mtH2O2), juega un papel en la regulación de la biosíntesis de colesterol del hepatocito mediada por SREBP.Inicialmente estudiamos el efecto de alteraciones en el contenido de colesterol sobre la expresión de mtAQP8 en células humanas derivadas de hepatocitos. Células Huh-7 fueron cargadas con colesterol utilizando el complejo metil-β-ciclodextrina (mβCD):colesterol, y depletadas de colesterol con mβCD en ausencia de lipoproteínas. El incremento del colesterol celular inhibió la activación proteolítica del SREBP-2, y como consecuencia de ello, se redujo significativamente la expresión, a nivel ARNm y proteína, de la enzima HMGCR. En estas condiciones, la expresión de mtAQP8, tanto del ARNm como de la proteína, disminuyó significativamente. La disminución a nivel proteico en la expresión de mtAQP8 fue también observada mediante microscopía confocal. Por el contrario, una reducción en el colesterol celular activó la proteólisis del SREBP-2, y aumentó la expresión (ARNm y proteína) de la HMGCR. La expresión de mtAQP8 incrementó significativamente a nivel ARNm y proteína lo cual también fue observado mediante microscopía confocal.En conclusión, nuestros datos sugieren que el colesterol regula transcripcionalmente la expresión hepática de la mtAQP8 a través de SREBPs.En otra etapa de este trabajo estudiamos si un aumento o disminución en la expresión de mtAQP8 podría modular la colesterogénesis en el hepatocito. Primeramente establecimos un knockdown de AQP8 en hepatocitos de rata en cultivo y en células Huh-7. Las células hepáticas con knockdown de mtAQP8 mostraron una disminución significativa de la biosíntesis de novo del colesterol. En concordancia, la expresión tanto de SREBP-2 como de su gen diana HMGCR, se vieron disminuidos de manera significativa.Cuando la expresión de mtAQP8 fue aumentada luego de exponer los cultivos de hepatocitos de rata a un adenovector codificante para la AQP8 humana (hAQP8), la biosíntesis de colesterol aumentó de manera significativa. En estas condiciones, SREBP-2 y HMGCR también aumentaron su expresión.Además, realizamos ensayos in vitro para cuantificar la liberación de mtH2O2 la cual se observó significativamente aumentada en mitocondrias provenientes de hepatocitos con sobre-expresión de mtAQP8 y disminuida en mitocondrias provenientes de hepatocitos con knockdown de mtAQP8.En base a esto, decidimos tratar los hepatocitos con Mitotempo, un antioxidante específico de mitocondria. Bajo estas condiciones se previno el aumento en la liberación de mtH2O2 así como el aumento en la síntesis de colesterol observado en la sobre-expresión de mtAQP8.En conclusión, nuestros resultados sugieren que mtAQP8 vía el H2O2 derivado de las mitocondrias, participa en la colesterogénesis controlada por SREBP en los hepatocitos. 2019-03-22T00:00:00Z